豬弓形蟲和附紅細胞體雙重PCR檢測方法的建立及應用

于新友，李天芝，張 穎，李 峰，沈志強，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600）

豬弓形蟲和附紅細胞體雙重PCR檢測方法的建立及應用

于新友1，李天芝1，張 穎2，李 峰2，沈志強1，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600）

根椐GenBank中登錄的豬弓形蟲和附紅細胞體核苷酸序列，分別設計2對引物，在建立各病原單項PCR技術的基礎上，優化雙重PCR反應條件，建立了2種病原的雙重PCR檢測方法，用這2對引物對同一樣品中的弓形蟲和附紅細胞體核酸模板進行雙重PCR擴增，結果可同時擴增弓形蟲的241 bp，附紅細胞體的748 bp的特異性片段，而對其它5份豬病原及對照的PCR擴增結果均為陰性。敏感性測定結果表明，該雙重PCR技術能檢出0.1 pg的弓形蟲和0.1 pg的附紅細胞體模板。用72份臨床病料對此研究雙重PCR技術和單項PCR技術進行對比驗證，結果顯示，兩者總符合率為100%。表明建立的雙重PCR檢測方法具有特異、快速、準確的特點，可用于對這兩種病原的同時檢測和鑒別診斷。

豬弓形蟲；附紅細胞體；雙重PCR；檢測

弓形蟲（Toxoplasma gondii,T.gondii）是世界性分布的寄生原蟲，廣泛寄生于人體及動物的有核細胞內，引起嚴重的人獸共患病[1]。豬對弓形蟲尤其易感，死亡率可高達60%以上[2]。臨床癥狀主要為呼吸困難，呈犬坐呼吸，耳尖、鼻端、四肢內側、腹下出現紫紅色斑塊，懷孕母豬表現為流產、死胎或產弱胎等。附紅細胞體病是附紅細胞體（Eperythrozoon suis, E.suis）寄生于多種動物和人紅細胞表面及血漿、骨髓內而引起的一種人獸共患病[3]。1932年Doyle首次報道了豬附紅細胞體病，并將其病原歸類立克次氏體[4]，后根據其16S rRNA基因序列與血巴通氏體有很近的親緣關系而將其劃為柔膜體綱支原體屬[5]。豬附紅細胞體病在我國豬群中廣泛存在，不同品種和日齡的豬均易感染，其中以哺乳仔豬和懷孕母豬受到的危害最嚴重[6]，臨床表現主要為貧血、黃疸、高熱、血尿，母豬不發情、不孕、流產、死胎等繁殖障礙性等，嚴重者可導致豬只死亡。由于豬弓形蟲和附紅細胞體病都是人獸共患病，因此，防治這兩種病具有重要的公共衛生意義。臨床上二者常呈混合感染，給養豬業造成了嚴重的損失。目前，對這兩種病均沒有效的疫苗和藥物進行預防，因此，快速、準確的診斷這兩種疾病，從而采取有效的防控措施非常有必要，對這兩種病原傳統的病原學及血清學檢測方法存在費時費力、檢出率不高、假陽性多等各種弊端。PCR檢測方法檢測速度快、敏感性高、特異性好，目前已經廣泛應用于各種疾病的診斷。已有很多采用PCR方法對這兩種病進行檢測的報道，但都是對單一病原的檢測。筆者根據弓形蟲SAG1和附紅細胞體16S rRNA保守基因序列設計引物，優化了反應條件，建立一種可用于上述兩種病原的雙重PCR診斷方法，并對臨床病料進行檢測，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 病原

豬弓形蟲、附紅細胞體、豬瘟病毒、豬圓環病毒2型、豬肺炎支原體、豬鏈球菌2型、巴氏桿菌和健康豬抗凝血由山東省濱州畜牧獸醫研究院預防獸醫學與動物生物技術重點開放實驗室保存。臨床檢測樣品為2016年3—8月采自魯北地區豬場豬抗凝血。

1.2 工具酶及試劑盒

pMD18-T載體、Premix Tag、DL 2 000 Marker購自大連寶生物公司，多功能DNA純化回收試劑盒、高純質粒小量制備試劑盒購自北京百泰克生物科技有限公司產品，裂解液由本實驗室自己配制。

1.3 引物的設計與合成

參考GenBank中登錄的弓形蟲（DQ104423）和附紅細胞體（JQ710901）基因序列，利用 Primer Premier 5.0軟件設計2對特異性引物（表1），由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，用滅菌水溶解并配成15 pmol/mL溶液備用。

表1 附紅細胞體和弓形蟲基因擴增引物

1.4 病原基因組的提取

參照文獻[7]提取病原基因組DNA，具體方法如下：取純化的弓形蟲或附紅細胞體懸液100 μL加入1.5 mL離心管中，加入1 mL裂解液 [100 mmol/L NaCl、20 mmol/L EDTA、pH 7.5 20 mmol/L三（羥甲基）氨基甲烷（Tris-HCl）、2%十二烷基磺酸鈉（SDS）]，在液氮和56℃水浴中反復凍融3次，加入5～6 μL（20 mg/mL）蛋白酶K，使其終濃度為100 μg/mL。混勻后在56℃水浴2 h。用酚∶氯仿∶異戊醇（24∶25∶1）進行抽提兩次，12 000 r/min離心10 min。將上面的水相小心吸取到滅菌的EP管中。在水相中加入3 M醋酸鈉（pH 5.2）60～70 μL，再加入2倍體積的冷乙醇在-20℃冰箱中沉淀1 h。將沉淀完全的樣品在4℃冷凍離心機中12 000 r/min離心30 min，棄上清后再用75%酒精洗滌一遍。棄酒精后晾干，用TE緩沖液或是滅菌四蒸水溶解，-20℃保存，備用。并提取其它幾種病原的核酸。

1.5 反應條件優化

最適退火溫度的確定：分別以46、48、50、52、54、56、58℃的退火溫度進行梯度PCR反應，對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳觀察，確定最佳退火溫度。

最適引物濃度的確立：在25 μL PCR反應體系中分別以0.2、0.3、0.4、0.6、0.8和1.0 pmol/μL的引物濃度進行PCR擴增，產物進行瓊脂糖凝膠電泳觀察，確定最佳引物濃度，篩選出雙重PCR反應體系的最佳反應模式。

1.6 特異性試驗

用已建立的雙重PCR擴增，分別對豬弓形蟲、附紅細胞體、豬瘟病毒、豬圓環病毒2型、豬肺炎支原體、豬鏈球菌2型、巴氏桿菌和健康豬抗凝血的模板進行擴增，擴增反應同時設雙蒸水陰性對照，擴增反應結束后進行凝膠電泳檢測，以檢驗雙重PCR的特異性。

1.7 雙重PCR的敏感性試驗

分別提取弓形蟲和附紅細胞體的DNA，用儀器測定含量，并依次做10倍梯度稀釋，每個稀釋度取1 μL為模板，采用已優化的雙重PCR反應條件分別對上述不同稀釋度的DNA進行雙重PCR擴增，反應結束后進行凝膠電泳檢測，以檢測建立的雙重PCR的敏感性。

1.8 重復性試驗

用建立的雙重PCR檢測方法分別對弓形蟲感染的8份陽性樣品、附紅細胞體感染的6份陽性樣品及5份陰性樣品，分別重復檢測3次，以驗證本方法的重復性和穩定性。

1.9 臨床樣品的檢測

對采自濱州、德州、東營、淄博等魯北地區豬場的72份抗凝血樣品進行雙重PCR檢測，對擴增產物全部進行測序鑒定，并利用生物學軟件BLAST進行序列分析。

2 結果與分析

2.1 反應條件的優化

通過對豬弓形蟲和附紅細胞體雙重PCR引物濃度及擴增溫度、時間和循環次數等的優化，最后確定雙重PCR中最佳引物濃度分別為弓形蟲引物0.4pmol/μL、附紅細胞體引物0.6 pmol/μL。雙重PCR的最佳反應模式為：94℃ 5 min，94℃ 30 s，52℃30 s，72℃ 30 s，30個循環，最后72℃延伸10 min。

2.2 擴增產物的檢測

將弓形蟲和附紅細胞體的核酸分別進行雙重PCR擴增，結果能擴增出與預期相符，弓形蟲的241 bp，附紅細胞體的748 bp的特異性片段，而對照擴增不出任何條帶，其擴增產物的電泳結果見圖1。

圖1 單項PCR擴增結果

2.3 特異性試驗

采用建立的雙重PCR方法對豬弓形蟲、附紅細胞體、豬瘟病毒、豬圓環病毒2型、豬肺炎支原體、豬鏈球菌2型、巴氏桿菌、健康豬抗凝血和水對照在相同的條件進行擴增。結果顯示，弓形蟲和附紅細胞體的PCR產物的片段長度分別為241 bp和748 bp，與預期大小一致，而豬瘟病毒、豬圓環病毒2型、豬肺炎支原體、豬鏈球菌2型、巴氏桿菌、健康豬抗凝血和水對照均未擴增出片段，瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2，說明本研究建立的雙重PCR方法特異性強。

圖2 特異性試驗

2.4 敏感性試驗

提取弓形蟲和附紅細胞體基因組DNA，用儀器測定含量，然后做10倍梯度稀釋，每個稀釋度取1 μL作為模板。結果顯示，用0.1 pg的弓形蟲和0.1 pg的附紅細胞體仍然可以擴增出特異性條帶（圖3），表明該雙重PCR敏感性強。

圖3 敏感性試驗

2.5 重復性試驗

經過3次重復操作，結果一致，表明本研究建立的雙重PCR方法是穩定可靠的。

2.6 臨床樣品的檢測

對72份在不同地區采集的抗凝血樣品，用建立的雙重PCR和單項PCR進行檢測，兩者符合率達100%（表2），且測序結果與預期一致，表明建立的雙重PCR檢測體系的特異性和敏感性較好。

本文研究結果顯示,實施優質護理服務模式的觀察組患者的骨折愈合時間顯著短于實施常規護理的對照組,關節功能恢復情況也顯著優于對照組,觀察組的護理滿意度顯著優于對照組,差異均有顯著統計學意義(P<0.05)。該研究結果與相關文獻[5]報道相符。綜上所述,應用優質護理服務模式對骨折患者進行護理干預,促進骨折愈合,能夠顯著提高患者的骨折恢復優良率,值得臨床上廣泛應用。

表2 被檢病料單項PCR與雙重PCR檢測對比試驗結果

3 討論

豬弓形蟲病特異PCR診斷的遺傳標記主要有B1基因、ITS序列、529 bp重復序列、致密顆粒蛋白、SAG1基因等，SAG1是弓形蟲的主要表面抗原基因，表達的約占蟲體蛋白總量的3%～5%，能被弓形蟲感染急性期或恢復期血清抗體識別，是誘導宿主免疫應答的主要靶抗原。豬附紅細胞體16S rRNA基因高度保守，可作為檢測的靶基因。

王海燕等[8]根據弓形蟲B1基因設計引物，建立診斷弓形蟲病特異性的PCR方法，結果顯示，該法最低能檢測到10個弓形蟲速殖子DNA，且與寄生于豬體內的6種常見微生物無交叉反應。閆若潛等[9]以豬弓形蟲核糖體DNA第一內轉錄間隔區（ITS1）序列為模板設計引物，建立了豬弓形蟲病特異PCR診斷方法，該法可從基因組DNA中擴增出273 bp的目的DNA片段，特異性好，敏感性高，最低能檢測到的弓形蟲DNA量為0.001 ng，且與相關的9種對照寄生蟲、細菌和病毒無交叉反應。張浩吉等[10]根據豬附紅細胞體16S rRNA基因設計引物，建立了豬附紅細胞體PCR檢測方法。該法對其它7種病原的基因組DNA沒有擴增帶出現，對豬附紅細胞體基因組DNA的最小檢測量為160pg。張影等[11]根據GenBank上發表的豬附紅細胞體DnaJ基因序列設計引物，建立了豬附紅細胞體PCR診斷方法，結果顯示，該法擴增不出犬新孢子蟲、牛附紅細胞體、犬附紅細胞體等基因片段，最低檢測豬附紅細胞體DNA量為124 fg/μL。

臨床上豬弓形蟲病、附紅細胞體病常和其它病原如豬瘟病毒、豬藍耳病病毒、豬圓環病毒2型、豬鏈球菌2型、豬巴氏桿菌等混合感染，使患豬死亡率增加，且這些混合感染的病原引起的臨床癥狀類似，因此必須借助實驗室診斷才可以確診。此外，許多豬群感染豬弓形蟲或附紅細胞體后可以不表現明顯臨床癥狀而處于潛伏感染狀態，但一旦外界環境改變或患其它疾病或機體的抵抗力降低時，則會引發這兩種疾病。因此建立弓形蟲病原的檢測方法對于該病的早期診斷、檢測、防治及豬群的凈化非常必要。對豬弓形蟲和豬附紅細胞體傳統檢測方法都有不足之處，病原學診斷涂片檢測僅適合于弓形蟲病急性暴發性病例的死后診斷，而對慢性感染或經藥物治療后的豬意義不大，容易造成漏檢。血清學診斷不能判斷現癥感染，對臨床病例確診沒有太大意義，PCR檢測適合弓形蟲現癥感染的診斷。豬附紅細胞體血液涂片染色鏡檢常常受到血液里不明微生物、染料顆粒和非病原性物質等因素的干擾，血清學方法存在抗原純度低、來源不足等缺點，因此，PCR是檢測這兩種病原的最佳方法。

在雙重PCR反應中，引物的設計很重要，對雙重PCR反應是否成功起著決定性的作用。本研究分別針對弓形蟲SAG1和附紅細胞體16S rRNA保守基因序列設計引物，優化了雙重PCR擴增反應條件，確定了雙重PCR中弓形蟲和附紅細胞體最佳引物濃度和最佳退火溫度，方法特異性好，檢測靈敏度高。臨床應用檢測結果顯示，72份抗凝血樣品中檢測的豬弓形蟲的陽性率為18.1%，豬附紅細胞體的陽性率為66.7%，二者混合感染樣品4份，混合感染率為5.6%，雙重PCR方法與單項PCR檢測結果符合率為100%。與單項PCR檢測相比可節省50%的時間和1/2的試劑用量，減少了污染環境的機會，對臨床上豬弓形蟲病和附紅細胞體病的檢測具有較好的應用價值。

[1]趙蕾，于新友，王金良，等.弓形蟲病疫苗研究進展[J].中國獸藥雜志，2011，45（6）：48-52.

[2]閆若潛，劉光輝，趙雪麗，等.豬弓形蟲特異性PCR診斷方法的建立及應用[J].中國動物檢疫，2007，24（3）：28-31.

[3]孫剛，孫光，郭昭林.動物附紅細胞體病[J].黑龍江畜牧獸醫，2003（12）：72-73.

[4]Heinritzi K.Eperythrozoon infection in swine as a disease factor[J].Berl Munch Tierarztl Wochenschr,1989,102(10)：337-342.

[5]Wu J,Yu J,Song C,et al.Porcine eperythrozoonosis in China[J]. Annals of the New York Academy of Sciences,2006，1081：280-285.

[6]Hoelzle L E.Haemotrophic mycoplasmas:Recent Advances in Mycoplasma suis[J].Vet Microbiol,2008，130(3-4)：215-226.

[7]于新友.微小隱孢子蟲病毒轉染載體的構建及GFP在其體內的表達[D].長春：吉林大學，2007.

[8]王海燕，馬廣鵬，任慶娥，等.豬弓形蟲病PCR診斷方法的建立[J].河南農業大學學報，2008，42（5）：524-527.

[9]閆若潛，劉光輝，趙雪麗，等.豬弓形蟲特異性PCR診斷方法的建立及應用[J].中國動物檢疫，2007，24（3）：28-31.

[10]張浩吉，謝明權，張健騑，等.豬附紅細胞體PCR檢測方法的建立和初步應用[J].中國獸醫學報，2005，25（5）：480-483.

[11]張影，賈立軍，薛書江，等.豬附紅細胞體DnaJ基因PCR診斷方法的建立及應用[J].中國獸醫雜志，2013，49（1）：24-27.

（編輯：郭玉翠）

城市嘈雜易致記憶力喪失

【《印度時報》網站11月12日報道】題：研究發現生活在繁忙、吵鬧的城市會導致人記憶力喪失

有時，記憶隨著年齡喪失是正常現象，這是衰老的跡象。但經常性喪失記憶，比如忘記每天的任務或想不起某人的名字，則可能預示著一個嚴重得多的問題。

土耳其阿吉巴代姆醫院神經科醫生內爾吉茲·許塞伊諾說，記憶喪失與生活在大城市壓力大有明顯關系。

蘇格蘭研究人員將這種狀況稱為繁忙生活方式綜合征（BLS），其癥狀包括沮喪、壓力大、注意力無法集中。

在阿爾茨海默病或帕金森病患者中常見記憶喪失現象，但環境因素使這一現象在年輕人中也越來越常見。

許塞伊諾說：“如果出現了一些令人擔心的跡象，比如遇到熟人時認不出來，或者反復問同樣的問題，那就要咨詢神經科醫生了。”

盡管女性的記憶力好于男性，但女性若感到沮喪也會導致忘事。

許塞伊諾總結道：“恰當的睡眠習慣、不吸煙、經常服用維生素是防止記憶喪失的有效手段。”

（轉自參考消息[N]，2016-11-17）

Establishment and Application of a Duplex PCR Assay for Detection of Toxoplasma Gondii and Eperythrozoon Suis

YU Xinyou1,LI Tianzhi1,ZHANG Ying2,LI Feng2,SHEN Zhiqiang1,2
(1.Shandong Lvdu Bio-Industry Co.,Ltd.,Binzhou 256600,China; 2.Animal Science and Veterinary Medicine Academy,Binzhou 256600,China)

To identify and differentiate rapidly the cause of clinical diseases.A duplex polymerase chain reaction was optimized to simultaneously detect two pathogens ofToxoplasma gondii (T.gondii)and Eperythrozoon suis(E.suis)in this article.Two sets of specific primers were designed according to the sequences of T.gondii and E.suis at the GenBank.By using two pairs of virus specific primers,two PCR assay were established to amplify the conservative regions of the two viruses,respectively.Consequently,a duplex PCR method to detect the two viruses in one tube was developed.The duplex PCR system would amplify a 241 bp for T.gondii and 748 bp fragment for E.suis imultaneously or separately in the samples,depending on its infection status.But not specific band amplified from other seven pig pathogeny and control article.As little as 0.1 pg of T.gondii and 0.1 pg of E.suis DNA were detected using gel electrophoresis in the duplex PCR.To evaluate the duplex PCR,72 clinical samples were comparatively detected.The data showed that the duplex PCR method being 100%coincidence with the single PCR,and it can be used for this two pathogeny detection and differential diagnosis.

Toxoplasma gondii;Eperythrozoon suis;duplex PCR;detection

S858.28

A

1002-1957(2016)06-0121-04

2016-09-05

山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊項目（SDAIT-08-17）

于新友（1983-），男，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事豬病診斷技術研究工作.E-mail：yuxinyou.2006@126.com