豬偽狂犬病病毒強毒株鑒別檢測方法研究進展

李 嬌，謝金文，李 峰，沈志強，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600）

豬偽狂犬病病毒強毒株鑒別檢測方法研究進展

李 嬌1，謝金文2，李 峰2，沈志強1，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600）

為配合PRV（豬偽狂犬病病毒）gE基因缺失疫苗的推廣應用，及時、準確地淘汰PRV強毒感染豬，逐步實現PRV的凈化，急需加強PRV強毒株鑒別診斷方法的研究開發與推廣應用。文章就近年來針對PRV強毒株各種鑒別診斷方法的最新研究進展進行綜述，以期為我國PR（豬偽狂犬病）綜合防控措施的制定提供參考依據。

豬偽狂犬病病毒；強毒株；鑒別診斷方法；研究進展

豬偽狂犬病（Pseudorabies,PR）是由豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的以母豬繁殖障礙、仔豬高病死率和呼吸道疾病為主要特征的一種急性、敗血性傳染病[1-2]。該病于1902年被首次發現，我國于1947年首次報道。自20世紀90年代以來我國全面推廣使用PRV gE基因缺失疫苗，由于該疫苗具有良好的免疫原性，我國有效地控制了該病的發生與流行[3]。但自2011年以來，我國多個省份陸續暴發PR疫情或PRV gE基因缺失疫苗免疫豬場突然野毒抗體轉陽，PR在我國發病率和死亡率明顯升高[4]，給我國養豬業造成了巨大的經濟損失。PR將是未來幾年內危害我國養豬業健康發展的主要疫病之一，故加強PRV強毒株鑒別診斷技術的研究對保障我國養豬業健康發展至關重要。本文就近年來針對PRV強毒株各種鑒別診斷方法的最新研究進展進行綜述，以期為我國PR綜合防控措施的制定提供參考依據。

1 PCR方法

趙雪麗等[5]根據PRV強毒具有gD表面抗原基因和gE毒力基因，而基因缺失疫苗只有gD基因無gE基因的特性，針對gD/gE基因的5′端核苷酸序列分別設計引物，建立鑒別PRV gE基因缺失疫苗和強毒感染的二重PCR診斷方法，該方法最低檢出限為100拷貝/μL，可特異性地擴增出PRV細胞毒中的gD和gE基因及gE基因缺失疫苗毒中的gD基因，但對PK-15細胞和豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬圓環病毒2型（PCV2）、豬細小病毒（PPV）、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬鏈球菌（S.suis）、副豬嗜血桿菌（HPS）等病原的檢測均為陰性。對835份臨床疑似PR感染病料中共檢測出PRV gD和gE基因雙陽性樣品即強毒感染陽性樣品267份，隨機選取該方法檢測出的26份PRV強毒感染樣品用于病原分離培養，兩種方法的符合率為96.1%。建立的PRV gE基因缺失疫苗和強毒感染的快速鑒別診斷方法靈敏、特異，對于臨床上疫苗毒和強毒感染的快速鑒別診斷具有重要意義。張志等[6]以疫苗株缺失的3.5 kb片段為靶基因，設計了2對PCR引物，建立了能夠特異性檢測PRV強毒株的套式PCR方法。該方法檢測極限可達10拷貝/μL，敏感性是常規PCR方法的1 000倍，并與CSFV、PRRSV、PPV和PCV2等不存在交叉反應。檢測150份臨床樣品，套式PCR方法的陽性率為21.33%，常規PCR方法的陽性率僅為10%。該方法具有特異性高、敏感性強的特點，是一種值得基層推廣應用的快速診斷技術，可用于PRV的診斷和流行病學調查等。PCR方法操作簡單、檢測快速、敏感、特異，套式PCR方法的敏感性更高，適合于基層實驗室進行PRV強毒株感染的快速診斷與流行病學調查等。

2 熒光定量PCR方法

實時熒光定量PCR方法是結合常規PCR技術和光譜技術發展起來的一種新型分子生物學定量檢測技術，與常規PCR方法相比具有敏感性更高、全封閉反應、不需核酸電泳檢測、適時定量等優點。呂素芳等[7]根據PRV強毒SA株的gD和gE基因序列設計引物，并對反應條件進行優化，建立了檢測PRV gE基因缺失病毒株的SYBR GreenⅠ實時定量PCR方法，其靈敏度比傳統PCR方法高100倍，檢測PCV2、PPV、CSFV、PRRSV均為陰性，可用于病原學監測、流行病學調查及定量研究。陳如敬等[8]根據PRV gE基因序列設計特異性實時熒光定量引物，建立基于SYBR GreenⅠ染料的PRV實時熒光定量PCR方法，該方法檢測PRV gE基因在7.53×10-1～7.53×10-6拷貝/μL范圍內有較好的線性關系，檢測PCV2、PPV、S.suis、HPS核酸均為陰性，組內和組間變異系數分別為0.31%～1.14%和0.42%～1.74%，該方法敏感性高、特異性強、重復性好，為深入開展PRV強毒感染的診斷以及對宿主致病機制的研究提供了檢測手段。余波等[9]根據PRV gE基因序列設計特異性的引物，PCR擴增獲得PRV gE基因片段，構建重組質粒pMD18-T-gE作為陽性標準品，對SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR反應條件進行優化，建立PRV SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR診斷方法，組裝了診斷試劑盒，該試劑盒在4℃保存1年陽性拷貝數降低100倍，在-20℃保存1年陽性拷貝數檢測的偏差在10個拷貝數以內。該試劑盒特異、靈敏、快速、重復性好，適于PRV野毒株臨床樣品的檢測，可應用于PRV野毒株早期感染和潛伏感染檢測，有利于PR的凈化。熒光定量PCR方法的靈敏度更高，但該方法對儀器設備和操作人員技術水平要求較高，一般基層實驗室由于不具備試驗條件而無法開展。

3 LAMP方法

張莉等[10]針對PRV gE基因保守區域設計并合成了4條引物，建立了PRV野毒株的LAMP檢測方法，并進行了特異性、敏感性和重復性試驗，該方法可特異性地檢測PRV強毒株，檢測PRRSV、PPV、CSFV、豬流感病毒（SIV）、PRV gE基因缺失疫苗株均為陰性。該方法的最低檢測量可達100個拷貝質粒DNA，比常規PCR方法的敏感性高10倍。該LAMP方法具有較高的特異性、敏感性和可重復性，可用于偽狂犬病病毒的快速診斷。LAMP方法無需PCR儀等儀器設備，僅需1個恒溫水浴鍋即可完成整個反應過程，操作簡單，檢測快速，非常適合于基層獸醫實驗室和養殖場開展PRV強毒株的鑒別診斷。

4 核酸探針方法

核酸探針技術是近幾年迅速發展起來的一種新型分子生物學技術，劉志杰[11]通過PCR方法擴增了304 bp的PRV gE基因片段，將其作為核酸探針來對PRV野毒株進行檢測，該探針只與PRV野毒株gE基因同源DNA出現陽性雜交信號，而與PRV gE基因缺失疫苗株、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV的雜交結果均為陰性，該探針最低可檢出4 pg的同源DNA，具有很高的特異性和敏感性，可用于PRV野毒株的檢測。核酸探針方法根據堿基互補配對原則，特異性更強，敏感性更高，但操作復雜、繁瑣，專業人員需要一定的技術水平，一般實驗室很難具備試驗條件。

5 ELISA（酶聯免疫吸附試驗）方法

雷有玲等[12]參照已發表的PRV基因組gE基因序列，設計合成1對特異性引物，PCR擴增了長約606 bp的gE基因片段，將目的片段亞克隆至pET30a原核表達載體中，經IPTG誘導重組gE蛋白的表達，重組蛋白純化后，免疫印跡檢測證明具有良好的抗原性和特異性。以純化蛋白為包被抗原，經間接ELISA反應條件的優化，建立了檢測PRV野毒抗體的間接ELISA方法，該方法檢測豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、PPV、PRRSV、CSFV、PCV2、PRV疫苗毒的陽性血清均為陰性，批內與批間重復性試驗的變異系數分別小于5%和10%，與IDEXX gE-ELISA抗體檢測試劑盒的符合率為96.2%。該gE-ELISA檢測方法為PRV野毒抗體檢測以及野毒感染的快速診斷與流行病學調查等提供了一種簡便、快速、高通量的血清學檢測方法。吳程華等[13]采用gE-ELISA檢測方法對云南省楚雄地區散養戶PRV野毒感染情況進行調查，楚雄地區9個散養戶154份血清樣本中，抗PRV gE抗體的陽性率為25.32%，表明楚雄地區散養戶PRV野毒株感染率較高。黨占國等[14]采用gE-ELISA檢測方法對2012—2015年16個省240個規模化豬場的7 443份血清樣品進行PRV野毒抗體的檢測，2012年、2013年、2014年、2015年PRV野毒感染抗體陽性率分別為39.4%、39.6%、43.8%、50.8%，表明我國豬場豬偽狂犬病野毒感染呈逐年上升趨勢，感染依然嚴重。ELISA方法操作簡單、檢測快速、敏感性高、特異性強、穩定性好，非常適用于大批量樣品的檢測，在基層獸醫部門進行大規模流行病學調查中得到了廣泛應用，具有良好的應用前景。

6 膠體金免疫層析法

白靜等[15]采用PCR方法擴增了600 bp的gE基因片段，將其克隆至pET-22b原核表達載體中，經IPTG誘導重組gE蛋白的表達，蛋白質斑點雜交結果顯示重組蛋白具有良好的抗原性。利用金屬螯和層析柱對重組蛋白進行純化后，獲得了抗原濃度為1.25 mg/mL的純化抗原，以檸檬酸鈉還原法制備了直徑為15～20 nm的膠體金顆粒，將純化蛋白透析后用膠體金顆粒進行標記，將純化蛋白透析后噴膜形成抗原線，并以PRV多克隆抗體噴膜形成質控線，組裝了檢測PRV野毒抗體的膠體金試紙條。該試紙條檢測CSFV、PRV gE基因缺失疫苗株、PPV、豬喘氣病、豬萎縮性鼻炎等均為陰性，該試紙條與美國IDEXX酶聯免疫試劑符合率在98%以上。膠體金免疫層析法具有快速、簡便、靈敏、特異性好等特點，無需任何設備20 min內可出檢測結果，非常適用于基層實驗室和養殖戶。

7 小結與展望

為配合PRV gE基因缺失疫苗在我國的推廣應用，及時、準確地淘汰PRV野毒感染豬，逐步實現PR的凈化，急需加強PRV野毒株鑒別診斷技術的研究開發與推廣應用。在PRV的強毒鑒別診斷方法中，常規PCR方法操作簡單、檢測快速，是目前PRV病原學調查采用的主要方法，但該方法敏感性低于熒光定量PCR、核酸探針、LAMP等方法，容易出現漏檢。熒光定量PCR方法彌補了常規PCR方法不能定量的缺點，且其敏感性大幅提高，但該方法對儀器、試劑、操作人員的要求均較高，限制了在基層獸醫部門的推廣應用。核酸探針和LAMP方法均是新興的分子生物學檢測方法，對儀器、試劑、操作人員的要求較低，但敏感性太高，易導致假陽性結果。ELISA方法操作簡單、高通量，是目前PRV野毒抗體檢測和血清學調查的主要方法。膠體金免疫層析方法較ELISA方法操作更簡單、檢測更快速、成本更低廉，但ELISA和膠體金免疫層析方法等血清學方法不能檢測到PRV強毒的早期感染和潛伏感染。綜合判斷，PRV野毒株的各種鑒別診斷方法均具有各自的優缺點，檢測人員可根據自身試驗條件選擇適合的方法。相信隨著分子生物學和血清學技術的不斷發展，PRV強毒鑒別診斷方法亦會得到不斷完善，不斷為PR的診斷、流行病學調查、綜合防控、凈化提供保障。

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（編輯：柳青）

S858.285.3

A

1002-1957(2016)06-0090-03

2016-09-07

山東省現代農業產業技術體系生豬創新團隊項目（SDAIT-06-022-15）

李 嬌（1981-），女，滿族，遼寧鐵嶺人，助理研究員，碩士，主要從事動物疫病診斷技術研究.E-mail:lijiao_zone@163.com