熒光定量PCR技術(shù)在豬瘟病毒定量檢測中的應(yīng)用

祖立闖，李 嬌，謝金文，李 峰，沈志強，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

熒光定量PCR技術(shù)在豬瘟病毒定量檢測中的應(yīng)用

祖立闖1，李 嬌1，謝金文2，李 峰2，沈志強1，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬瘟（Classical swine fever,CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病[1]，該病流行范圍廣、致死率高、危害性大，是目前危害我國養(yǎng)豬業(yè)的頭號殺手[2]。近年來我國豬瘟發(fā)病趨勢出現(xiàn)了明顯的變化，發(fā)病率明顯降低的同時出現(xiàn)了所謂的非典型豬瘟、溫和型豬瘟和無名高熱綜合征等[3]，使豬瘟野毒感染的臨床診斷以及豬瘟強毒株與疫苗毒的鑒別診斷變得非常困難但又十分必要，亟待建立一種可以準(zhǔn)確鑒別診斷豬瘟病毒強毒株敏感而特異的檢測方法。同時，由于豬瘟病毒不產(chǎn)生細胞病變，《中華人民共和國獸藥典》中對豬瘟疫苗的疫苗效力檢驗采用兔體定型熱反應(yīng)方法[4]，該方法利用試驗動物進行檢測，成本較高、周期較長、操作繁瑣，動物個體差異對試驗結(jié)果影響較大，亟待建立新型實用、標(biāo)準(zhǔn)化的疫苗效力檢驗替代方法。熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號的累積實時監(jiān)測整個PCR反應(yīng)進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析[5]。通過對PCR過程的實時監(jiān)控，可專一、靈敏、快速、重復(fù)地精確定量起始模板濃度，真正實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，擁有特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點[6]，成為了分子生物學(xué)研究的重要工具，為豬瘟的臨床診斷以及鑒別診斷、豬瘟疫苗效力檢驗等提供了技術(shù)支持。本文就熒光定量PCR技術(shù)在豬瘟病毒基礎(chǔ)性研究、豬瘟病毒臨床診斷、豬瘟疫苗效力檢驗、豬瘟病毒強毒株與疫苗株鑒別診斷等豬瘟病毒定量檢測中的研究與應(yīng)用進展進行綜述，以期為提高我國豬瘟防控水平提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 熒光定量PCR技術(shù)在豬瘟病毒基礎(chǔ)性研究中的應(yīng)用

熒光定量PCR方法的敏感性高，能夠準(zhǔn)確定量，對分析病毒的組織定位及病毒刺激相關(guān)細胞免疫因子的定量檢測提供了技術(shù)支持。牛金鵬等[7]為分析急性感染期豬瘟病毒的組織定位，及豬瘟病毒感染導(dǎo)致豬急性死亡的致病機理，根據(jù)GenBank中發(fā)表的豬瘟病毒石門株強毒基因序列，選擇5'UTR相對保守區(qū)域設(shè)計1對引物，經(jīng)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測豬瘟病毒的熒光定量RTPCR檢測方法，應(yīng)用該方法對人工感染豬瘟病毒死亡病例的心、肝、脾、肺、腎、腹股溝淋巴結(jié)、腦、骨髓、扁桃體、回腸、血清和腸內(nèi)容物等臟器中的豬瘟病毒進行了定量檢測，扁桃體中豬瘟病毒含量最高，脾臟和回腸次之，心、肺、血清中病毒含量也比較高，淋巴結(jié)、肝臟、腎、骨髓和腦中病毒含量較低，該SYBR熒光定量PCR方法揭示了豬瘟強毒在急性感染期死亡豬體內(nèi)的分布情況，為豬瘟致病機理及感染控制的研究奠定了基礎(chǔ)。汪志艷等[8]為從細胞免疫水平評價豬瘟病毒弱毒疫苗的免疫效果，針對GenBank中豬IFN-γ、IL-2、TNF-α的基因設(shè)計特異性引物和熒光探針，建立了檢測這3種細胞因子Taq Man熒光定量RT-PCR方法，應(yīng)用3種細胞因子Taq Man熒光定量RT-PCR方法對豬瘟活疫苗進行細胞免疫評價，IFN-γ、IL-2、TNF-α mRNA表達量在豬瘟病毒弱毒疫苗免疫后3～10 d之間均顯著升高，而IFN-γ在14 d仍保持高水平表達，表明在豬瘟活疫苗免疫后3 d，豬只已經(jīng)啟動了機體的細胞免疫系統(tǒng)，IFN-γ、IL-2、TNF-α的mRNA表達量均顯著上調(diào)，機體開始發(fā)揮其細胞免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，成功解釋了豬瘟疫苗免疫后2～3周才能夠監(jiān)測到中和抗體，但在疫苗免疫后2～4 d，豬只卻能夠?qū)姸竟舢a(chǎn)生一定抵抗力的原因。

2 熒光定量PCR技術(shù)在豬瘟病毒臨床診斷中的應(yīng)用

目前，我國動物疫病感染情況日益復(fù)雜，混合感染情況不斷增加，僅憑臨床癥狀很難對致病原進行確診。一般確診豬瘟病毒主要依據(jù)病毒的分離鑒定、RT-PCR、ELISA、膠體金試紙條、熒光抗體試驗等，但這些檢測方法均有其不足，比如病毒分離鑒定耗時長，ELISA、膠體金試紙條、熒光抗體試驗等血清學(xué)方法敏感性較低、不能早期檢測，普通RT-PCR方法敏感性有限，且不能對病毒進行定量。熒光定量PCR以其快速、高效、特異、靈敏、定量準(zhǔn)確等廣泛應(yīng)用到豬瘟病毒的臨床診斷中。2012年錦州市周邊一存欄200頭的豬場，突然暴發(fā)以肥育豬厭食、精神不振、體溫高熱達40℃、可視黏膜和皮膚有針尖大小密集出血點為主要特征的疫病，采集病死豬的組織病料，應(yīng)用豬瘟實時熒光定量RT-PCR方法檢測證實此次疫病由豬瘟病毒感染所致[9]。熒光定量PCR技術(shù)特異、敏感，為臨床豬瘟病毒感染的診斷和制定科學(xué)合理的凈化方案提供了技術(shù)保障。

3 熒光定量PCR技術(shù)在豬瘟疫苗檢驗中的應(yīng)用

豬瘟兔化弱毒疫苗在豬瘟防控中起著重要的作用，但豬瘟弱毒疫苗的抗原效價或疫苗效力檢驗主要采用兔體定型熱反應(yīng)方法，該方法受試驗操作、試驗動物的個體差異、環(huán)境因素及原材料等多方面原因限制了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。鑒于實時熒光定量PCR技術(shù)具有敏感性高、特異性強、高通量檢測等優(yōu)點，最主要的是能夠?qū)Σ《竞窟M行定量監(jiān)測，已被廣泛地應(yīng)用于豬瘟疫苗的檢驗中。范斌等[10]在豬瘟兔化弱毒活疫苗病毒基因組5'非編碼區(qū)設(shè)計1對標(biāo)準(zhǔn)品引物、1對特異性引物和1條探針，建立了評價豬瘟兔化弱毒疫苗中病毒含量的實時熒光定量RT-PCR方法，該方法檢測的敏感度達1.2×105拷貝/mL，應(yīng)用該方法對6個不同廠家生產(chǎn)的7種豬瘟兔化弱毒活疫苗的效價進行檢測，不同廠家疫苗的效價差異明顯，最高可相差3個數(shù)量級，建議在選擇豬瘟疫苗免疫接種前應(yīng)該先定量檢測疫苗中病毒含量，根據(jù)病毒含量進行免疫接種。章秋月等[11]收集福建省內(nèi)使用的10個不同廠家生產(chǎn)的23個批次豬瘟弱毒疫苗，應(yīng)用熒光定量RTPCR方法檢測疫苗中病毒核酸的含量，抽檢23個豬瘟疫苗樣品合格率僅為69.56%，其中傳代細胞苗的病毒含量相對較高，脾淋苗病毒含量優(yōu)于細胞苗，不同廠家生產(chǎn)的同類型疫苗病毒含量差異大，同一廠家生產(chǎn)的同類疫苗存在批間差異。實時熒光定量RT-PCR檢測豬瘟疫苗病毒含量是一種便捷、高效的方法，為豬瘟疫苗的檢驗提供了科學(xué)、有效的指導(dǎo)依據(jù)。

4 熒光定量PCR技術(shù)在豬瘟病毒強毒株與疫苗株鑒別診斷中的應(yīng)用

豬瘟兔化弱毒疫苗的廣泛使用對控制豬瘟的流行起到了關(guān)鍵作用，但由于該疫苗為活疫苗，且沒有分子標(biāo)記，使豬瘟疫苗免疫豬與豬瘟病毒強毒株感染豬難以區(qū)分，給豬瘟病毒強毒株的鑒別診斷帶來很大困難。傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)、兔體定型熱反應(yīng)法、動物接種試驗、ELISA、免疫熒光試驗、膠體金試紙條等檢測技術(shù)均不能對疫苗株和強毒株進行區(qū)分，RT-PCR方法雖可以實現(xiàn)強毒株與疫苗株的鑒別診斷，但常規(guī)RT-PCR方法敏感性較低，容易漏檢。熒光定量RT-PCR方法的敏感性較常規(guī)RTPCR高，且可以實現(xiàn)準(zhǔn)確定量，可以作為豬瘟病毒強毒株與疫苗株的鑒別診斷技術(shù)在臨床中推廣應(yīng)用。杜冬華等[12]為建立豬瘟病毒野毒株和疫苗株快速定量鑒別檢測方法，分別根據(jù)野毒株和疫苗株E2基因序列差異設(shè)計2對特異性引物及1條TaqMan探針，建立了能同時檢測豬瘟病毒野毒株和疫苗株的雙重TaqMan real-time PCR鑒別檢測方法，該雙重TaqMan real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值與1×101～1×106拷貝/μL之間的E2基因拷貝數(shù)呈良好的線性關(guān)系，靈敏度達10拷貝/μL，且特異性和重復(fù)性很好。豬瘟病毒野毒株與疫苗株熒光定量鑒別檢測方法可用于豬瘟病毒野毒株和疫苗株的鑒別診斷及病原定量分析，將為我國豬瘟病毒野毒株感染及疫苗免疫情況的調(diào)查與分析提供高效、快速的檢測手段，為更好地防控豬瘟的發(fā)生與流行奠定了基礎(chǔ)。

5 小結(jié)與展望

實時熒光定量PCR方法是結(jié)合常規(guī)PCR技術(shù)和光譜技術(shù)發(fā)展起來的一種新型分子生物學(xué)定量檢測技術(shù)，與常規(guī)PCR方法相比具有敏感性更高、特異性更強、定量準(zhǔn)確、全封閉反應(yīng)、自動化檢測、不需核酸電泳檢測、高通量等優(yōu)點，成為目前豬瘟病毒檢測中最準(zhǔn)確的方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的日趨完善，其在豬瘟病毒的定量檢測中將會得到進一步完善和應(yīng)用，將逐步成為豬瘟疫苗效力檢驗的替代評價方法、豬瘟病毒臨床診斷尤其是豬瘟病毒強毒株與疫苗株鑒別診斷的主要方法，以及豬瘟病毒基礎(chǔ)性研究必不可少的重要方法。雖然該技術(shù)需要價格昂貴的儀器設(shè)備、試劑，但隨著國家對動物疫病實驗室建設(shè)資金投入的不斷增加，熒光定量PCR技術(shù)將逐步成為豬瘟病毒檢測中最準(zhǔn)確、適合現(xiàn)場應(yīng)用的方法，不斷為我國豬瘟的綜合防控事業(yè)提供強有力的技術(shù)支持。

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（編輯：柳青）

S858.285.3

A

1002-1957(2016)06-0119-02

2016-10-13

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊建設(shè)任務(wù)（SDAIT-08-17）

祖立闖（1981-），男，黑龍江賓縣人，助理研究員，碩士，主要從事動物疫病診斷技術(shù)研究.E-mail:zulichuang2008@126.com