山西豬鏈球菌2型主要毒力相關基因的克隆及分析

王紅寶，李紅麗，郭雪麗，韓惠瑛，楊晉青，段亞娜，王志俊，吉 濤

（1.山西省農業科學院畜牧獸醫研究所，山西 太原 030032；2.山西省動物疫病預防控制中心，太原 030027）

山西豬鏈球菌2型主要毒力相關基因的克隆及分析

王紅寶1，李紅麗1，郭雪麗1，韓惠瑛2，楊晉青1，段亞娜1，王志俊1，吉 濤1

（1.山西省農業科學院畜牧獸醫研究所，山西 太原 030032；2.山西省動物疫病預防控制中心，太原 030027）

為了解37株豬鏈球菌2型（S.suis 2）山西分離株的毒力基因型及毒力基因變異情況，通過PCR擴增S.suis 2毒力基因GDH、SLY、EPF、MRP，對這4種毒力基因的擴增片段進行測定，并與國內外其他分離株的基因進行比較。結果顯示，GDH、SLY、EPF、MRP基因在37株S.suis 2中的檢出率分別為86.5%、70.3%、56.8%、62.2%；37個受試菌株毒力基因型主要為GDH+/SLY+/EPF+/MRP+占51.35%，為優勢基因型；S.suis 2山西分離株4種毒力基因與國內其他地區S.suis 2分離株的相應基因之間同源性均在99.1%以上，與國外S.suis 2分離株的相應序列同源性在89.9%～100%之間。

山西；豬鏈球菌；毒力基因；克隆；分析

豬鏈球菌病是由鏈球菌引起的豬的一種常見傳染性疾病[1-2]。豬鏈球菌為人畜共患傳染病病原，在特定的條件下也可導致人感染發病，特別是豬鏈球菌2型是一種重要的人畜共患傳染病病原，豬鏈球菌2型感染也是一種人畜共患的急性、熱性傳染病[3]，世界各國均有發生。鏈球菌廣泛存在于污染的環境中，可以通過消化道、呼吸道及經傷口感染，本病也可由蚊、蠅等昆蟲類傳播。各類豬只都有易感性，感染后可致豬腦膜炎、敗血性肺炎、心內膜炎及關節炎等。在豬群中常見散發或呈地方性流行，對我國養豬業造成巨大經濟損失[4]。根據豬鏈球菌莢膜多糖（Capsular polysaccharide）抗原性的不同，豬鏈球菌有1～34型和同時含有1型和2型抗原的1/2型，共可分成35個血清型[5-7]，其中豬鏈球菌2型流行最廣，致病力最強[8-9]。致病性強弱與其毒力基因密切相關，毒力基因主要包括莢膜多糖合成酶（capsular polysaccharide biosynthesis,CPS）、谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase,GDH）、溶血素（suilysin, SLY）、胞外因子（extracellular protein factor,EPF）、溶菌酶釋放蛋白（murimidase released protein,MRP）、纖粘連蛋白/纖粘連蛋白結合蛋白（fibroneetin-biningprotein,FBPS）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）、毒力相關序列ORF2基因（virulent-associate sequence ORF2）。其中，MRP和EPF已被證明是強毒株的標志；SLY是一種巰基活化類毒素，可能在菌體入侵和裂解細胞過程中發揮作用[10-11]；GDH是一種新近發現的豬鏈球菌進化上極其保守的種特異性抗原成分，該蛋白抗原是一種極好的診斷抗原，可準確地檢測豬鏈球菌感染。

“山西省豬鏈球菌病菌株分離鑒定及防治技術研究”項目組于2011—2016年從山西省主要養豬區的養豬場（戶）剖解病豬及病死豬，采集相關病變部位的病料，分離鑒定出80株致病菌株，其中有37株屬基因2型[12]。本研究于2014—2016年對其中屬基因2型的37株進行了主要毒力相關基因的克隆及分析，現將研究情況匯報如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及培養條件 山西省豬鏈球菌病菌株分離鑒定及防治技術研究項目組2011—2016年從山西省主要養豬區的養豬場（戶）分離鑒定的37株S.suis 2菌株應用于研究。pMD-18T載體購自寶生物工程（大連）有限公司。大腸桿菌感受態細胞，由本課題組制備保存。

菌種的初步復蘇：將含有7%無菌綿羊血的THB瓊脂糖固體培養基于37℃靜置培養；菌株增殖：將THB液體培養基，37℃180 r/min搖床培養。

1.1.2工具酶和主要試劑 DL 2 000 DNA Marker、rTaq DNA聚合酶、限制性內切酶BanⅡ、BamH I、Sal I、氨芐西林、無菌綿羊血、Premix TaqTM、基因組提取試劑盒等均購自TaKaRa公司；蛋白酶K購自Merck公司；Todd-Hewitt Broth（THB）為美國BD公司產品。DNA膠回收試劑盒（DNA Gel Extraction Kit）購自北京百泰克生物技術有限公司。腦心浸液培養基、溴化乙錠（EB）、瓊脂糖、乙二胺四乙酸（EDTA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris堿）、十二烷基磺酸鈉（SDS）等分別購自TaKaRa、華美生物工程公司等。

1.1.3 主要儀器設備 高速臺式冷凍離心機（MIKRO 22R型）為HITTACH公司產品；Ultrospec 2000型紫外分光光度計為Bio-Rad公司產品；PCR儀UNII型、轉移電泳槽，購自Biometra公司；Alpha Inotech凝膠成像系統購自美國Bio-RA公司；xw-80A型旋渦混合器購自上海青浦滬西儀器廠；HZS-H型水浴振蕩器為哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司產品；可調式恒溫水浴箱購自polystat cc1，HUBER公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆

（1）引物設計。根據文獻[13-15]，以GenBank中收錄的豬鏈球菌2型的毒力相關基因序列為參考，經分析后，利用Priner 5.0和Oligo 6.0軟件設計GDH、SLY、MRP、EPF的特異性引物，引物均由大連寶生物工程有限公司合成，引物序列見表1。引物合成后，用ddH2O稀釋成濃度為10 μmol/L的溶液，-20℃保存備用。

表1 擴增目的基因所需引物

（2）PCR模板的制備。根據文獻[16]描述的方法，并做適當改進。將豬鏈球菌分離株從-70℃冰箱內取出，挑取小塊冰晶劃線接種于綿羊血平板上培養復蘇，挑取單菌落接種于腦心浸液培養基中，37℃恒溫水浴過夜培養；取1 mL菌液置于1.5 mL Eppendorf管中，4℃12 000 r/min離心1 min，棄上清液，并將殘余液滴吸凈；加入200 μL DNA提取液，60℃水浴1 h；然后95℃水浴10 min，冷卻至室溫，12 000 r/min離心5 min，取上清液保存于-20℃冰箱備用。

（3）毒力基因的PCR擴增。PCR反應采用25 μL反應體系。體系的組成為：10×Buffer 2.5 μL，氯化鎂2.5 μL（25 mmol/L），dNTP 2 μL（2.5 mmol/L），上游引物（25 pmol/μL）1 μL，下游引物（25 pmol/μL）1 μL，模板2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，補加ddH2O至25 μL。95℃預變性5 min，經變性、退火、延伸等反復試驗，確定各基因最佳循環參數如表2，PCR產物分別用0.8%～1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。

表2 目的基因的擴增

（4）基因的克隆與鑒定。采用DNA凝膠回收試劑盒（DNA Gel Extraction Kit）回收純化擴增片段，按照DNA凝膠回收試劑盒說明進行操作。T載體（30 ng/μL）2 μL，T4連接酶1 μL，回收DNA片段適量并加水補至10 μL，于4℃反應14～16 h，然后轉化大腸桿菌感受態細胞。通過藍白斑篩選含有目的質粒的大腸桿菌菌落，挑取白色菌落擴大培養，堿裂解法提取質粒。對所提質粒進行PCR鑒定和BamH I、Sal I雙酶切鑒定。

1.2.2 基因測定與分析 經鑒定為陽性的重組質粒送往大連寶生物工程有限公司進行核苷酸序列測定。為保證測序精確性，每個片段送2個質粒，根據2個質粒測序結果以及與參考毒株序列比較結果確定最終序列。應用分析軟件DNAStar對GDH、SLY、EPF和MRP基因序列及其翻譯后的氨基酸序列與GenBank中已收錄序列進行同源性比較分析。

2 結果與分析

2.1 毒力基因的PCR擴增結果

以豬鏈球菌山西分離株為模板，用設計合成的引物分別建立擴增單個靶基因的PCR體系。檢測結果顯示，37株S.suis 2山西分離株，GDH、SLY、EPF、MRP基因檢出率分別為86.5%（32/37）、70.3%（26/37）、56.8%（21/37）、62.2%（23/37）；37個受試菌株中GDH+/SLY+/EPF+/MRP+占51.35%（19/37），為優勢基因型；各菌株毒力因子具體攜帶情況詳見表3。

表3 豬鏈球菌2型毒力基因檢測

部分試驗菌株的毒力基因PCR檢測電泳結果如圖1—圖4。

圖1 毒力基因GDH的PCR檢測電泳

圖2 毒力基因SLY的PCR檢測電泳

圖3 毒力基因EPF的PCR檢測電泳

圖4 毒力基因MRP的PCR檢測電泳

2.2 毒力基因分析結果

應用分析軟件DNAStar對S.suis 2山西分離株的GDH、SLY、EPF和MRP基因及其翻譯后的氨基酸序列與GenBank中已收錄基因進行同源性比較分析。結果表明，S.suis 2山西分離株4種毒力基因的檢測與國內其他地區S.suis 2分離株的相應基因同源性均在99.1%以上，與國外S.suis 2分離株的相應基因同源性在89.9%～100%之間。

2.2.1 同源性分析 將32株S.suis 2山西分離株的GDH基因與國內、國外S.suis 2參考菌株的同源性分別為99.7%～100%、99.1%～100%。19個S.suis 2山西分離菌株的SLY基因部分序列與國內、國外S.suis 2參考菌株的同源性分別為100%和99.1%～100%。19個S.suis 2山西分離菌株的EPF基因部分序列與國內、國外S.suis 2參考菌株的同源性分別為99.6%～100%和89.9%～100%。19個S.suis 2山西分離菌株的MRP基因部分序列與國內、國外S.suis 2參考菌株的同源性分別為99.4%～100%和99.1%～100%。

2.2.2 基因變異分析 對19株S.suis 2山西分離株進行基因變異分析，結果發現，菌株SX-LL2、SXYC1菌株的MRP基因的比對序列中第64—65位存在TA插入突變，菌株SX-LF4的MRP基因的比對序列中第52位由T突變為C。菌株SX-YQ2的MRP基因的比對序列中第52位由T突變為C。GDH、SLY、EPF基因分析未檢出變異。

3 討論

根據已公開發表的相關報道和筆者在長期的工作實踐中發現，并不是所有的S.suis 2都具有致病性，縱使有致病性的，其致病性也有強有弱。根據其致病力的不同，從無到有，由弱到強，可將其分為無致病力菌株、弱致病力菌株和強致病力菌株。

國內外目前對豬鏈球菌致病性研究，主要集中在CPS、GDH、SLY、EPF、MRP、FBPS、GAPDH、ORF2這8種毒力因子上。本研究選擇了其中最主要的GDH、SLY、EPF、MRP做為研究對象，是因為MRP和EPF已被證明是強毒株的標志；SLY是一種巰基活化類毒素，可能在菌體入侵和裂解細胞過程中發揮作用[10-11]；GDH是一種新近發現的豬鏈球菌進化上極其保守的種特異性抗原成分，該蛋白抗原是一種極好的診斷抗原，可準確地檢測豬鏈球菌感染。研究結果發現，山西S.suis 2分離株，GDH基因檢出率最高（32/37），其次是 SLY（26/37）、EPF（21/37）和 MRP（23/37）；37個受試菌株中GDH+/SLY+/EPF+/MRP+占51.35%（19/37），為優勢基因型。有報道認為豬鏈球菌2型菌株采集部位，也就是其存在的部位不同，與其不同的毒力因子表型分布有一定的關系，我們將在以后的研究中進一步的研究。

本研究通過對S.suis 2山西分離株主要毒力相關因子的克隆和分析，了解了山西豬鏈球菌2型的毒力分布情況，對進一步研究和防控豬鏈球菌病提供了依據。

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（編輯：富春妮）

Cloning and Analysis on the Major Virulence-associated Gene in Shanxi Strain ofStreptococcus SuisSerotype 2

WANG Hongbao1,LI Hongli1,GUO Xueli1,HAN Huiying2,YANG Jinqing1,DUAN Ya'na1,WANG Zhijun1,JI Tao1
(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Taiyuan 030032, China;2.Animal Disease Prevention and Control Center in Shanxi Province,Taiyuan 030027,China)

To understand 37 strains of Streptococcus suis serotype 2(S.suis 2)from Shanxi isolates of virulence genes and virulence gene variants,by PCR amplification S.suis 2 virulence genes GDH,SLY,EPF,MRP,of the four kinds of virulence gene fragments amplified were determined,and comparing with other isolates genetic at home and abroad.Results show that the GDH,SLY,EPF,MRP gene in 37 strains S.suis 2 detection rate respectively in:86.5%,70.3%,56.8%,62.2%;37 participants strain virulence genes on GDH+/SLY+/EPF+/MRP+is the main advantage of accounted for 51.35%of participants strain genotype;S.suis 2 isolates in Shanxi four virulence genes and other domestic regions S.suis corresponding gene homology between two isolates were over 99.1%,with foreign S.suis 2 isolates the corresponding sequence homology between 89.9%～100%.

Shanxi province;swine Streptococcus suis;virulence genes;cloning;analysis

S858.282.61+1

A

1002-1957(2016)06-0107-04

2016-09-26

山西省農業科學院科技攻關項目（2012ygg35）

王紅寶（1968-），男，山西翼城人，副研究員，主要從事動物疫病診斷和防治研究工作.E-mail:sxnkywhb@163.com

郭雪麗，副研究員.E-mail:sxnkygxl1969@163.com