豬胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

車勇良，陳如敬，吳學(xué)敏，王晨燕，王隆柏，劉玉濤，周倫江

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013）

豬胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

車勇良，陳如敬，吳學(xué)敏，王晨燕，王隆柏，劉玉濤，周倫江

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013）

福建省某豬場(chǎng)豬出現(xiàn)呼吸困難、氣喘和咳嗽，病死豬肺臟有纖維素性胸膜肺炎病變，從病變肺臟中分離出一株革蘭氏陰性短小球桿菌，生化試驗(yàn)表明，該菌能發(fā)酵木糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖、果糖和葡萄糖。經(jīng)PCR擴(kuò)增、克隆和測(cè)序確定該菌為豬胸膜肺炎放線桿菌。動(dòng)物試驗(yàn)表明，該菌對(duì)小鼠具有致病性。藥敏試驗(yàn)顯示，該分離菌株只對(duì)阿莫西林、頭孢噻肟和青霉素這3種藥物敏感，而對(duì)氟苯尼考、替米考星、四環(huán)素、鏈霉素、強(qiáng)力霉素、環(huán)丙沙星、林可霉素、壯觀霉素和磺胺嘧啶鈉呈現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。該研究為豬場(chǎng)用藥提供了參考依據(jù)。

豬胸膜肺炎放線桿菌；分離；鑒定；藥敏試驗(yàn)

豬傳染性胸膜肺炎（Porcine infectious pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropeumoniae,APP）引起的豬的一種高度接觸性傳染性呼吸道疾病，主要特征是急性出血性纖維素性胸膜肺炎和慢性纖維素性壞死性胸膜肺炎[1]。該病多為繼發(fā)，其發(fā)生多與細(xì)菌的毒力、豬體的健康狀況及豬舍衛(wèi)生條件等因素密切相關(guān)。自1957年首次報(bào)道以來，該病已在歐美、日本、中國(guó)等全世界范圍廣泛傳播[2]。我國(guó)自從1987年發(fā)現(xiàn)該病以來，該病在我國(guó)各個(gè)省份有愈演愈烈之勢(shì)，尤其是近幾年來，隨著我國(guó)豬場(chǎng)規(guī)?；⒓s化的發(fā)展，豬傳染性胸膜肺炎的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

根據(jù)APP生長(zhǎng)是否需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），分為兩個(gè)生物型，即生物Ⅰ型（NAD依賴菌株）和生物Ⅱ型（非NAD依賴型）[4]，根據(jù)APP表面莢膜多糖和脂多糖抗原性的不同，又分為15個(gè)血清型，生物Ⅰ型包括血清型1～12型和15型，生物Ⅱ型包括13型和14型。各血清型之間的交叉保護(hù)性不強(qiáng)，其中1、4和6型之間及3、6和8型之間有較好的交叉反應(yīng)[5]。

本研究對(duì)福建省某豬場(chǎng)采集的疑似病豬肺臟進(jìn)行了細(xì)菌分離培養(yǎng)及鑒定，通過藥敏試驗(yàn)，篩選出高敏藥物，為豬場(chǎng)臨床治療提供了參考。

1 材料與方法

1.1 病料采集

病料于2015年5月20日采集自福建省某豬場(chǎng)。哺乳仔豬在20日齡左右開始出現(xiàn)呼吸困難、打噴嚏、咳嗽和消瘦等臨床癥狀，哺乳仔豬斷奶成活率為70%，保育豬成活率也為70%，肥育豬成活率為80%。剖檢病變顯現(xiàn)為出血性肺炎、胸膜炎和心包炎，支氣管和氣管內(nèi)分泌物增多。

1.2 試驗(yàn)材料

胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）和胰酶大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）均購(gòu)自BD Difco公司，小牛血清從杭州四季青公司購(gòu)得，金黃色葡萄球菌由福建省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所豬病研究室保存，NAD購(gòu)自Roche公司，分子生物學(xué)試劑pMD18-T質(zhì)粒載體、Taq酶和DNA Marker均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌分離與純化 用火焰滅菌的接種針挑取病豬肺臟，劃線接種于TSA培養(yǎng)板，并在接種線的垂直方向劃線接種金黃色葡萄球菌，放置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48 h后，觀察菌落形態(tài)并挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。并將可疑單菌落接種于TSA培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)，直至菌落形態(tài)大小均一、色澤一致為止。

1.3.2 生化試驗(yàn) 使用微生物生化管進(jìn)行生化鑒定，包括尿素酶接觸試驗(yàn)、溶血性試驗(yàn)、過氧化氫試驗(yàn)、衛(wèi)星現(xiàn)象等，糖發(fā)酵反應(yīng)試驗(yàn)包括：木糖、甘露醇、棉子糖、阿拉伯糖、麥芽糖、蔗糖、果糖和葡萄糖等。

1.3.3 細(xì)菌基因組DNA提取 挑取純化后的單個(gè)菌落接種于含5%小牛血清和0.005%NAD的TSB液體培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。離心沉淀后加入PBS重懸，按照分子克隆2[6]的CTAB/NaCl方法提取細(xì)菌基因組DNA，自然干燥后溶于TE中-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 細(xì)菌16S rRNA的PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中胸膜肺炎放線桿菌的16S rRNA序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，上游引物AP1：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'，下游引物AP2：5'-GGTACCTTGTTACGACTT-3'。以提取的細(xì)菌基因組DNA為模板，采用特異性引物AP1/AP2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min、94℃變性40 s、52℃復(fù)性40 s、72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。100 V、1%瓊脂糖電泳40 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.3.5 DNA序列測(cè)定 通過電泳回收PCR產(chǎn)物，回收純化后的產(chǎn)物送公司測(cè)序。

1.3.6 16S rRNA基因序列分析 應(yīng)用DNAMAN分析軟件對(duì)分離的細(xì)菌16S rRNA序列與GenBank中公布的不同血清型菌株16S rRNA序列進(jìn)行同源性比較分析。

1.3.7 動(dòng)物試驗(yàn) 選取10只8周齡Balb/c小鼠分為2組，一組將純培養(yǎng)的細(xì)菌液（計(jì)數(shù)為1.5×108cfu/mL）注射小鼠腹腔，0.5 mL/只，共注射5只。另外一組作為對(duì)照組，注射培養(yǎng)基，0.5 mL/只，共注射5只。攻毒后連續(xù)觀察10 d，計(jì)算小鼠死亡情況。

1.3.8 藥敏試驗(yàn) 用接種針挑取分離的細(xì)菌涂布于TSA培養(yǎng)板中，選擇藥敏紙片粘貼于培養(yǎng)基上，放置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察并測(cè)定抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 胸膜肺炎放線桿菌的分離純化與菌落形態(tài)特征

從病豬肺臟中分離出一株細(xì)菌，菌落在TSA血平板上呈灰白色、半透明、表面光滑、濕潤(rùn)的圓形小菌落。在葡萄球菌附近形成“衛(wèi)星狀”生長(zhǎng)，且離葡萄球菌越近，生長(zhǎng)的菌落越多；反之，離葡萄球菌越遠(yuǎn)，生長(zhǎng)的菌落越少。細(xì)菌經(jīng)革蘭氏染色后為革蘭氏陰性，呈細(xì)小短桿狀，少數(shù)為長(zhǎng)絲狀。細(xì)菌傳代培養(yǎng)時(shí)在鮮血TSA瓊脂平板上生長(zhǎng)良好，在巧克力瓊脂平板上生長(zhǎng)快速，在普通肉湯瓊脂平板上不生長(zhǎng)。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

通過觀察發(fā)現(xiàn)，胸膜肺炎放線桿菌的尿素酶、過氧化氫酶呈現(xiàn)陽(yáng)性，可以分解木糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖、果糖和葡萄糖，但不能分解棉子糖和阿拉伯糖。

2.3 PCR分析結(jié)果

分離細(xì)菌經(jīng)PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示目的片段在1 402 bp左右（圖1），凝膠回收試劑盒回收純化該片段。

圖1 胸膜肺炎放線桿菌16S rRNA基因的PCR結(jié)果

2.4 16S rRNA測(cè)序及同源性分析

回收PCR目的片段送測(cè)序公司測(cè)序，應(yīng)用DNAMAN軟件對(duì)所測(cè)序列與GenBank上公布的胸膜肺炎放線桿菌16S rRNA序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示分離細(xì)菌與GenBank中公布的胸膜肺炎放線桿菌16S rRNA序列同源性在99%以上（表1）。

表1 細(xì)菌16S rRNA基因序列同源性比較

2.5 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

小鼠腹腔攻毒后24 h內(nèi)，攻毒小鼠5只全部死亡，而對(duì)照組未出現(xiàn)死亡。表明該細(xì)菌對(duì)小白鼠有致病性。

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

用直尺測(cè)量各藥敏紙片的抑菌圈直徑，分析對(duì)分離細(xì)菌的敏感藥物（表2）。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

近年來，豬傳染性胸膜肺炎在全世界范圍廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7-8]。病豬常表現(xiàn)為精神沉郁、呼吸困難、氣喘和咳嗽，鼻腔流出泡沫或血性泡沫，通常2～4 d后死亡。剖檢主要表現(xiàn)為纖維素性肺炎、肺臟出血、胸腔積液或肺臟局部壞死。本研究動(dòng)物試驗(yàn)表明，該分離細(xì)菌對(duì)小鼠具有較強(qiáng)的致病性。本研究采集疑似病豬肺臟，對(duì)其細(xì)菌進(jìn)行分離并進(jìn)行了PCR、克隆和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中已登錄的豬胸膜肺炎放線桿菌進(jìn)行同源性比對(duì)，同源性均達(dá)到99%～100%。

APP感染后，很難從豬場(chǎng)根除，在患病早期用抗生素治療有效，但長(zhǎng)期用藥容易導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生[9]。本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，APP出現(xiàn)了多重耐藥，對(duì)強(qiáng)力霉素、替米考星、氟苯尼考、林可霉素、壯觀霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、鏈霉素和磺胺嘧啶鈉表現(xiàn)為耐藥，敏感的藥物只有阿莫西林、青霉素和頭孢噻肟。多重耐藥菌株的出現(xiàn)給豬傳染性胸膜肺炎的防治帶來了困難，這也是臨床難治愈的根本原因之一。而且，因?yàn)锳PP血清型眾多，市場(chǎng)上也沒有一種疫苗可防治所有血清型菌株引起的疾病，所以有必要對(duì)發(fā)病豬場(chǎng)進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定和藥敏試驗(yàn)，有針對(duì)性的指導(dǎo)臨床用藥。

[1]斯勞特，阿萊爾，蒙加林，等.趙德明，張中秋，沈建忠，譯.豬病學(xué)[M].第9版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2008.

[2]姚建聰，何啟蓋，王娟，等.豬傳染性胸膜肺炎診斷方法研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2003，24（2）：41-44.

[3]余燕，馬金友，王天有，等.豬接觸傳染性胸膜肺炎的診治[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（8）：107-108.

[4]厚華艷，梁武，呂茂杰，等.豬傳染性胸膜肺炎亞單位疫苗研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，36（2）：84-88.

[5]Grasteau A,Tremblay Y D,Labrie J,et al.Novel genes associated with biofilm formation of Actinobacillus pleuropneumoniae[J]. Vet Microbiol,2011,153(1-2):134-143.

[6]薩姆布魯克J，弗里奇E F，曼尼阿蒂斯T.金冬雁，黎孟楓，侯云德，等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].第2版.北京：科學(xué)出版社，1999：125-126.

[7]Nielsen R,Danielsen V.An outbreak of Glasser's disease. Studies on etiology,serology and the effect of vaccination[J]. Nord Vet Med,1975,27(1):20-25.

[8]達(dá)來寶力格.胸膜肺炎放線桿菌生物被摸突變體的篩選與生物學(xué)特性的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[9]Klinkenberg D,Tobias T J,Bouma A,et al.Simulation study of the mechanisms underlying outbreaks of clinical disease caused by Actinobacillus pleuropneumoniae in finishing pigs[J].Vet J, 2014,202(1):99-105.

（編輯：柳青）

污染物進(jìn)入大腦或致癡呆癥

【英國(guó)《每日電訊報(bào)》網(wǎng)站9月5日?qǐng)?bào)道】題：在人腦中發(fā)現(xiàn)了與阿爾茨海默癥有關(guān)的“空氣污染”微粒

科學(xué)家們警告說，汽車引擎和剎車產(chǎn)生的磁性微?？蛇M(jìn)入人的大腦，進(jìn)而可能引發(fā)阿爾茨海默癥。

蘭開斯特大學(xué)、牛津大學(xué)和曼徹斯特大學(xué)的研究人員，對(duì)曼徹斯特和墨西哥患有神經(jīng)組織退化疾病的37名患者的大腦進(jìn)行了檢查，發(fā)現(xiàn)了球狀磁鐵礦微粒。

這種磁性微粒是已知的有毒物質(zhì)，與自由基的產(chǎn)生有關(guān)，而自由基又與阿爾茨海默癥有關(guān)。

雖然以前在死于阿爾茨海默癥的患者大腦中發(fā)現(xiàn)過磁鐵礦，但當(dāng)時(shí)認(rèn)為它是天然產(chǎn)生的。然而，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)的這種球狀微粒有一個(gè)熔融表面，證明它們是在極熱時(shí)形成的，比如在汽車引擎中形成的。

磁鐵礦（鐵的一種氧化物）已知是在汽車引擎中產(chǎn)生的—特別是柴油機(jī)，其微粒的排放量是汽油機(jī)的22倍多。當(dāng)剎車時(shí)，汽車和火車都會(huì)產(chǎn)生這種微粒。明火和質(zhì)量不好的爐子也會(huì)產(chǎn)生這種磁性微粒。

研究人員說，這一發(fā)現(xiàn)為找到阿爾茨海默癥的病因打開了一個(gè)“全新的途徑”。而慈善機(jī)構(gòu)說，這為有毒粒子可能進(jìn)入大腦的說法提供了“令人信服的證據(jù)”。

這項(xiàng)研究的第一作者、蘭開斯特大學(xué)教授芭芭拉·馬厄說：“我們的研究結(jié)果表明，大氣中的磁鐵礦的納米粒子能進(jìn)入人類大腦，可能會(huì)對(duì)人類健康構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)，包括罹患阿爾茨海默癥等?！?/p>

“我們發(fā)現(xiàn)的微粒與城市空氣污染物、尤其是繁忙道路附近的空氣污染物中大量存在的磁鐵礦納米微粒球驚人地相似，后者是汽車引擎內(nèi)燃或剎車摩擦生熱形成的?！?/p>

蘭開斯特大學(xué)教授、阿爾茨海默癥研究專家戴維·艾爾索普表示：“這一發(fā)現(xiàn)為研究可能造成一系列腦病的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素提供了一個(gè)全新途徑?！?/p>

英國(guó)約有80萬人患有癡呆癥，其中多數(shù)為阿爾茨海默癥，而隨著人口老化，這一數(shù)字估計(jì)還將增加。

已知空氣污染與肺病和心臟病有關(guān)，而最近的研究表明，空氣污染可能也是造成認(rèn)知衰退的一個(gè)因素。美國(guó)2014年的一個(gè)研究報(bào)告證明，高度污染地區(qū)的人們腦力衰退的可能性增加50%。

不過，此前沒有人認(rèn)為那些微粒會(huì)進(jìn)入大腦。這個(gè)新的研究表明，微粒可以被吸入體內(nèi)并通過嗅神經(jīng)進(jìn)入大腦。嗅神經(jīng)負(fù)責(zé)將氣味信息帶給大腦。

（轉(zhuǎn)自參考消息[N]，2016-09-09）

S858.285.1

A

1002-1957(2016)06-0102-03

2016-09-19

福建省公益類科研專項(xiàng)（2010R1025-2）；福建省生豬產(chǎn)業(yè)體系

車勇良（1976-），男，江西臨川人，副研究員，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究.E-mail：cyl19760810@163.com

周倫江（1973-），男，福建周寧人，研究員，博士，主要從事畜禽傳染病防控研究.E-mail：lunjiang@163.com