維生素E對4℃保存藏豬精液品質和抗氧化保護作用的影響

陳曉英，馬金英，宋天增，唐建華，趙彥玲，任子利，朱彥賓，王良潤

（1.西藏自治區農牧科學院畜牧獸醫研究所，西藏 拉薩 850009；2.西藏自治區畜牧總站，拉薩 850000；3.西藏農牧學院動物科學學院，林芝 860000；4.西藏牧樂農業科技有限公司，拉薩 850009）

維生素E對4℃保存藏豬精液品質和抗氧化保護作用的影響

陳曉英1，馬金英1，宋天增1，唐建華2，趙彥玲3，任子利3，朱彥賓1，王良潤4

（1.西藏自治區農牧科學院畜牧獸醫研究所，西藏 拉薩 850009；2.西藏自治區畜牧總站，拉薩 850000；3.西藏農牧學院動物科學學院，林芝 860000；4.西藏牧樂農業科技有限公司，拉薩 850009）

試驗旨在研究維生素E對4℃藏豬精液品質和抗氧化保護作用影響，采用電刺激法采集健康藏豬精液，在改進的豬精液低溫稀釋液為基礎液中，每1 000 mL添加維生素E 0、3.0、4.0、5.0、6.0 g，將藏豬種公豬新鮮精液做4倍稀釋后于4℃環境保存至第5天，以藏豬精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質膜完整率為評價精液品質指標，以超氧化物歧化酶（Superoxidas dismutase,SOD）活力和丙二醛（Maleic dialdehyde,MDA）含量為評價抗氧化保護作用指標，探討維生素E對4℃藏豬精液品質影響。結果顯示：維生素E 5.0 g/L添加組藏豬精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質膜完整率均極顯著好于其他試驗組（P＜0.01）。精漿超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量以5.0 g/L維生素E添加組為最高；同時發現，5.0 g/L維生素E添加組精子超氧化物歧化酶活力與其他各組間差異不顯著。總之，在改進的豬精液稀釋液中添加5.0 g/L的維生素E可明顯改善4℃環境保存藏豬精液品質和抗氧化保護作用，此試驗研究為今后藏豬精液低溫保存的生產應用奠定了基礎。

維生素E；藏豬；4℃環境；精液品質；抗氧化保護

藏豬主要分布于雅魯藏布江流域中游河谷區和藏東三江流域中游海拔為3 500 m左右的氣候條件惡劣的高原地帶，是我國唯一的高原豬種[1-2]。藏豬具有肉質優良、耐嚴寒、耐粗飼、抗逆性強等優點。為降低養豬成本，可用藏豬在抗病性和適應性等方面優良的遺傳特性改良外種豬及其他地方豬的遺傳結構[3]。

豬精液保存技術推廣應用的重要性在于通過擴大精液使用的時間和地域范圍，提高優秀種公豬的利用效率，從而降低公豬飼養成本，加速豬的遺傳改良，避免通過交配傳播疾病，同時也在豬品種資源和原始資源及基因庫種質資源保存等方面起重要作用。豬精液的保存有液態保存和冷凍保存兩種，目前在生產實踐中應用的仍為液態保存中的常溫[4]或冷藏保存。冷凍可長期保存豬的精液，但因解凍后人工授精的受胎率很低[5]而無法推廣應用。公豬精液的低溫保存不如常溫保存效果好，公豬精液常溫保存在生產上具有較大的實用價值。常溫保存人工授精的效果好，且方便經濟，但受到保存時間的限制[6-9]，隨著保存時間的延長公豬精液會引發脂質過氧化，超氧化物歧化酶（Superoxidas dismutase,SOD）活力下降和丙二醛（Maleic dialdehyde,MDA）含量降低[10-11]，最終引發脂質過氧化，降低線粒體膜電位，提高等離子體膜透性，最終影響受胎率。而維生素E是一種脂溶性維生素，其水解產物為生育酚，是最主要的抗氧化劑之一，不易被酸、堿及熱所破壞，但卻極易被氧化。維生素E對線粒體、網狀組織或漿膜的磷脂有著特殊的親和性，存在于這些膜的特定部位。維生素E是重要的抗氧化劑，能通過抑制自由基的形成，阻止誘發的膜脂質發生過氧化，從而維持精子頂體膜的完整，提高精子頂體完整率和降低精子畸形率[12-13]。

4℃低溫保存，精子代謝活動水平低，脂質過氧化程度低，保存時間比常溫更長，同時可應用普通冰箱保存，經濟方便[14]。隨著現代化藏豬養殖生產技術的提高，為有效控制疫病傳播、降低飼養公豬的費用、提高豬群品質，解決藏豬精液的妥善保存問題，人工授精技術服務于藏豬產業發展已迫在眉睫。任子利等[14]研究了維生素C對藏豬精液4℃保存及其精子全基因組DNA甲基化的影響。本研究擬在任子利等[14]研究的基礎上，在改進的豬精液低溫稀釋液為基礎液中，每1 000 mL添加維生素E 0、3.0、4.0、5.0、6.0 g，將藏豬種公豬新鮮精液做4倍稀釋后于4℃環境保存至第5天，以藏豬精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質膜完整率為評價精液品質指標，以SOD活性和MDA含量為評價抗氧化保護作用指標，探討維生素E對4℃藏豬精液品質的影響。以期為藏豬精液低溫保存的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與材料

1.1.1 試驗動物與試驗地點 試驗藏豬為3～5歲健康種公豬6頭。試驗時間為2015年5—7月，試驗地點為西藏工布江達縣錯高鄉某藏豬養殖專業合作社、西藏自治區農牧科學院畜牧獸醫研究所和西藏大學農牧學院動物科學學院。

1.1.2 主要設備與試劑 動物電刺激采精儀（MDW-1，成都華智開物科技有限公司），倒置熒光顯微鏡（IX73，奧林巴斯），電熱恒溫水槽（DKB-450A，上海森信），變頻冰箱（BCD-649WDVC，海爾），-80℃冰箱（MDF-U33V，合肥榮事達三洋電器股份有限公司）。

維生素E（宜昌人福藥業有限責任公司）、考馬斯亮藍（國藥集團化學試劑有限公司）、Diff-Quik Stain染液（北京普博斯）、亞衛精液稀釋粉（丹麥）、速眠新Ⅱ（吉林省敦化市圣達動物藥品有限公司）、SOD試劑盒和MDA測定試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

新鮮藏豬精液由西藏工布江達縣錯高鄉某藏豬養殖專業合作社提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 改進的低溫稀釋液配制 參照孫時軍等[15]的試驗結果，使用亞衛牌精液稀釋劑作為基礎稀釋劑，在稀釋后的精液中加入1%乙二醇作為低溫保護劑。

1.2.2 精液采集及處理 采用速眠新Ⅱ（0.1 mL/kg）肌內注射麻醉健康藏豬種公豬，用動物電刺激采精儀于3 V、50 mA條件下電刺激法采集健康藏豬精液。

將藏豬精液（精子活力0.8以上）做4倍稀釋，用6層以上紗布包裹后放入培養箱中，17℃平衡2 h后，放入冰箱4℃保存。

1.2.3 精子質量評價 精子活力和精子畸形率兩項精液常規性狀參照世界衛生組織標準（WHO）[16]的方法測定，具體方法如下。

精子活力：精液過濾后立即在顯微鏡下觀察精子活力，采用百分制法，直線前進精子數占總精子數的百分比為精子活力。

精子畸形率：采用龍膽紫酒精溶液染色法，將精子涂片染色，在400倍顯微鏡下觀察，計算不同視野500個精子中畸形精子占比例即為畸形率（取3次計算的平均值）。

精子頂體完整率和精子質膜完整率兩項精液性狀參照文獻[17]進行評價。精子頂體完整率：考馬斯亮藍R250染色法。精子質膜完整率：低滲腫脹試驗—HOST。

1.2.4 精液抗氧化指標的測定 超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量的測定，使用SOD試劑盒和MDA測定試劑盒，采用比色法測定精漿和精子中總SOD的活性及MDA含量。具體方法參照文獻[18]進行。

1.3 試驗設計

1.3.1 維生素E對4℃保存藏豬精液品質的影響試驗分5組，在改進的豬精液低溫稀釋液為基礎液中，每1 000 mL添加維生素E 0、3.0、4.0、5.0、6.0 g，將藏豬種公豬新鮮精液做4倍稀釋后于4℃保存到第5天時以藏豬精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質膜完整率為評價指標，探討維生素E對4℃保存藏豬精液品質的影響。試驗重復3次。

1.3.2 維生素E對4℃保存藏豬精液抗氧化保護作用的影響 試驗分組同1.3.1。每次采精后收集精液，取10 mL鮮精液于玻璃離心管中，在4 000 r/min離心分離15 min，取精漿分裝于2 mL塑料離心管，置-80℃冰箱保存備用，用于精漿生化參數及抗氧化指標的測定。試驗重復3次。

1.4 數據處理

所得試驗數據用Excel進行前期處理，再用SPSS 11.5軟件進行One-Way ANOVA方差分析，并進行多重比較，試驗結果用平均數±標準差表示，檢驗誤差為5%和1%。

2 結果與分析

2.1 維生素E對4℃保存藏豬精液品質的影響

由表1可以看出，藏豬精液4℃保存到第5天時，5.0 g/L維生素E添加組的精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質膜完整率這4個指標均極顯著好于其他組（P＜0.01）。

表1 維生素E對4℃保存藏豬精液品質的影響（n=18）

2.2 維生素E對4℃保存藏豬精液抗氧化保護作用的影響

由表2可以看出，藏豬精液4℃保存到第5天時，精漿超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量以5.0 g/L維生素E添加組為最高；同時發現，5.0 g/L維生素E添加組精子超氧化物歧化酶活力與其他各組間差異不顯著；精子MDA含量以5.0 g/L維生素E添加組為最高，與3.0 g/L組差異極顯著（P＜0.01），與4.0、6.0 g/L組差異顯著（P＜0.05）。

表2 維生素E對4℃保存藏豬精液抗氧化保護作用的影響（n=18）

3 討論

3.1 維生素E對4℃保存藏豬精液品質的影響

維生素E能控制磷脂裂解生成二十碳四烯酸需要的磷酸酯酶A2的活性，二十碳四烯酸是所有前列腺素（prostaglandin,PG）的前體，間接影響PG的合成。精液稀釋后，PG的含量會有所下降和損失，添加維生素E可以起到彌補作用[19]，維持精子頂體膜的完整，提高精子頂體完整率和降低精子畸形率[12]。

本研究5.0 g/L維生素E添加量對高海拔地區藏豬精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質膜完整率為優，高于何蘭花等[20]在低海拔地區研究添加維生素E對豬精液保存的量3.5 g，但差距不大。這可能與生存環境的海拔區別引起的一系列生理生化指標的變化有關。

3.2 維生素E對4℃保存藏豬精液抗氧化保護作用的影響

維生素E被認為是精子抗氧化系統中最基本的組成成分，同時也是針對精液中氧自由基（ROS）和脂質過氧化的一種主要的膜保護物質，它是通過終止生物膜和膜蛋白的脂質過氧化反應鏈起作用。維生素E能通過抑制自由基的形成，阻止誘發的膜脂質發生過氧化[12]與本試驗研究在豬精液低溫稀釋液中添加維生素E可提高精漿超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量一致。

本試驗研究發現，在豬精液低溫稀釋液中添加維生素E，精子超氧化物歧化酶活力有所提高，但差異不顯著。與有關研究報道在飼糧中添加維生素E對精子的抗氧化能力影響不大一致。

4 結論

本研究結果表明，在改進的豬精液稀釋液中添加維生素E 5.0 g/L后將藏豬種公豬精液做4倍稀釋，可以明顯改善藏豬精液4℃保存的效果，同時可明顯提高4℃保存對藏豬精液抗氧化保護作用。本試驗研究將為藏豬精液低溫保存的生產應用奠定基礎。

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（編輯：郭玉翠）

手機玩得少，睡眠才能好

【英國《衛報》網站11月9日報道】研究人員告誡說，如果想晚上睡一個好覺，就別在睡前玩手機了。

美國的一項研究發現，睡眠模式被打亂，包括入睡時間加長，與盯著屏幕看的時間變長有關，尤其是在床上的時候。

研究報告的合著者、美國加利福尼亞大學舊金山分校的格雷戈里·馬庫斯說：“盯著屏幕的時間越長，睡眠質量越差。”

這一研究結果與越來越多表明使用電子設備會妨礙睡眠的證據相符。

英國薩里大學睡眠問題專家西蒙·阿徹說：“許多這類設備會發出藍光，這種藍光尤其成問題，因為它們抑制褪黑素。褪黑素在睡眠開始前的幾小時開始上升，這是身體告訴你要準備睡覺了。”

阿徹說，藍光對大腦也有一種警示作用，閱讀文章或郵件會帶來緊張情緒，而使用電子設備這種舉動本身也發揮著一定作用。

來自加利福尼亞大學舊金山分校的研究人員在《科學公共圖書館·綜合》期刊和心理保健應用程序上發表了這一研究結果。

在網上參與調查的人員被要求下載一個不斷自動收集屏幕亮起時長的應用程序。該研究小組對使用該程序至少達到30天的人進行了分析。

共有653名成年人完成了調查，結果顯示，參與者每小時花在智能手機上的時間平均為3.7分鐘。更年輕的人，以及沒有注明身份或者注明身份為“其他”的人，在手機上花費的時間更長。

進一步的分析表明，盯著屏幕的時間越長睡眠時間越短，而且在床上睡覺的時間越少。馬庫斯說，平均來看，每在手機上多花1分鐘時間，睡覺時間約減少5分鐘。

這項研究本身并沒有表明是否盯著屏幕的時間加長導致睡眠質量下降，或者睡眠質量不佳的人最終會更頻繁地使用手機。研究者表示，上網和使用臉書等應用程序對睡眠的影響效果還需要進一步研究。

（轉自參考消息[N]，2016-11-11）

Effect of Vitamin E on Tibetan Boar Semen Preserved at 4℃ and Antioxidative

CHENXiaoying1,MAJinying1,SONGTianzeng1,TANGJianhua2,ZHAOYanling3,RENZili3,ZHUYanbin1,WANGLiangrun4
(1.Institute of Animal Science,Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences,Lhasa 850009, China;2.The Tibet Animal Husbandry Service,Lhasa 850000,China;3.Faculty of Animal Science,Tibet Agricultural and Animal Husbandry College,Nyingchi 860000,China;4.Tibet Mulo Agricultural Sciences and Technology Co.,Ltd.,Lhasa 850009,China)

This study was conducted to investigate the effects of vitamin E on Tibetan boar semen preserved at 4℃and antioxidative.The semen was collected from Tibetan boar by electrical stimulation.Add vitamin E 0 g, 3.0 g,4.0 g,5.0 g,6.0 g per 1 000 mL,in the improvement of pig semen low temperature dilution liquid.Save to fifth days at 4℃after dilution of fresh semen.Body integrity and membrane integrity rate of the top Tibetan pig sperm activity,sperm abnormal rate and semen quality evaluation index,to investigate the effect of vitamin E on the quality of semen quality at 4℃,the activity of Superoxidas dismutase(SOD)and Maleic dialdehyde(MDA) were the indexes to evaluate the protective effect of antioxidation.The results show that,The sperm motility, sperm deformity rate,sperm motility rate and plasma membrane integrity rate of the vitamin E 5 g/L addition group were significantly better than other test groups(P＜0.01),seminal plasma superoxide dismutase activity and MDA content was the highest in the 5 g/L vitamin E group.Also,at the same time,we found that,it was not significant difference between the other groups for sperm superoxide dismutase activity with 5 g/L vitamin E supplementation group.In short adding 5 g/L vitamin E to the improved pig semen diluent can significantly improve the semen quality and antioxidant protection at 4℃.The experimental study laid a foundation for the production and application of cryopreservation of boar semen in the future.

vitamin E;Tibetan pig;environmental science at 4℃;semen quality;antioxidant protection

S828

A

1002-1957(2016)06-0037-04

2016-10-05

西藏自治區2016年高校青年教師創新支持計劃項目（NO.QCZ2016-47）；西藏自治區2016年農林業科技成果轉化與推廣（農牧業技術推廣）項目“特色畜禽（藏豬）營養調控研究”

陳曉英（1981-），女，甘肅武威人，助理研究員，碩士，主要從事高原畜禽繁殖技術研究工作.E-mail：chenxiaoying0891@163.com

宋天增（1980-），男，助理研究員，碩士，研究方向為動物繁殖營養調控與遺傳育種.E-mail：songtianzeng123@sina.com