半胱胺對(duì)4℃保存藏豬精液指標(biāo)的影響

陳曉英，馬金英，宋天增，唐建華，趙彥玲，任子利，朱彥賓，王良潤(rùn)

（1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏 拉薩 850009；2.西藏自治區(qū)畜牧總站，拉薩 850000；3.西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，林芝 860000；4.西藏牧樂(lè)農(nóng)業(yè)科技有限公司，拉薩 850009）

半胱胺對(duì)4℃保存藏豬精液指標(biāo)的影響

陳曉英1，馬金英1，宋天增1，唐建華2，趙彥玲3，任子利3，朱彥賓1，王良潤(rùn)4

（1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏 拉薩 850009；2.西藏自治區(qū)畜牧總站，拉薩 850000；3.西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，林芝 860000；4.西藏牧樂(lè)農(nóng)業(yè)科技有限公司，拉薩 850009）

試驗(yàn)旨在研究半胱氨酸對(duì)4℃藏豬精液品質(zhì)和抗氧化保護(hù)作用影響，采用電刺激法采集健康藏豬精液，在改進(jìn)的豬精液低溫稀釋液為基礎(chǔ)液中，每1 000 mL添加半胱氨酸0、0.02、0.04、0.06、0.08 g，將藏豬種公豬新鮮精液做4倍稀釋后于4℃環(huán)境保存至第5天，以藏豬精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率為評(píng)價(jià)精液品質(zhì)指標(biāo)，以超氧化物歧化酶（Superoxidas dismutase,SOD）活力和丙二醛（Maleic dialdehyde,MDA）含量為評(píng)價(jià)抗氧化保護(hù)作用指標(biāo)，探討半胱氨酸對(duì)4℃藏豬精液品質(zhì)影響。結(jié)果顯示：半胱氨酸0.06 g/L添加組藏豬精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率均極顯著好于其他試驗(yàn)組（P＜0.01），0.06 g/L半胱氨酸添加組的精漿超氧化物歧化酶活力含量均顯著好于其他試驗(yàn)組（P＜0.05），0.08 g/L半胱氨酸添加組的精漿丙二醛含量均顯著好于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，0.08 g/L半胱氨酸添加組精子超氧化物歧化酶活力最高，各組間差異不顯著，精子丙二醛含量0.06 g/L半胱氨酸含量最高。總之，在改進(jìn)的豬精液稀釋液中添加0.06 g/L半胱氨酸后將藏豬種公豬精液做4倍稀釋，可明顯改善4℃環(huán)境保存藏豬精液品質(zhì)和抗氧化保護(hù)作用，該試驗(yàn)研究為今后藏豬精液低溫保存的生產(chǎn)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

半胱氨酸；藏豬；4℃環(huán)境；精液品質(zhì)；抗氧化保護(hù)

半胱胺（cysteamine,Cs），又名β-巰基乙胺，分子式為NH2-CH2-CH2-SH，為半胱氨酸脫羧產(chǎn)物，是輔酶A（CoA）分子的組成部分，也是動(dòng)物體內(nèi)的生物活性物質(zhì)。

半胱氨酸是細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽生物合成的前體物質(zhì)[1]。Bilodeau等[2]證明像半胱氨酸之類的巰醇物質(zhì)，可以保護(hù)冷凍-解凍后的牛精子活力免受過(guò)氧化氫的傷害。10℃下添加半胱氨酸可以提高豬精子的活力、頂體完整性和體外穿透性[3]。何蘭花等[4]在含有氨基丁三醇和半胱胺酸的豬精液常溫保存稀釋粉中添加慶大霉素（100 IU/mL）和林肯霉素（200 μg/mL）作抗生素，在24～30℃、pH為6.4、稀釋倍數(shù)為1∶1時(shí)保存效果最佳。孫琪[5]試驗(yàn)表明以向豬精液稀釋液中添加2 mM的半胱氨酸提高三元雜交種豬精子保存質(zhì)量為最佳。馬乃祥[6]研制的豬精液稀釋液配方含有半胱胺酸0.07 g，精液能夠達(dá)到體外恒溫保存6 d時(shí)間，精子平均活力達(dá)0.7，與配繁殖母豬發(fā)情期受胎率達(dá)86%，窩產(chǎn)仔數(shù)平均11.2頭，仔豬產(chǎn)后死亡率減少13%，豬群健康率平均提高32%的技術(shù)指標(biāo)。高效精液稀釋液應(yīng)用于養(yǎng)豬生產(chǎn)并取得良好效果。

4℃低溫保存，精子代謝活動(dòng)水平低，脂質(zhì)過(guò)氧化程度低，保存時(shí)間比常溫更長(zhǎng)，同時(shí)可應(yīng)用普通冰箱保存，經(jīng)濟(jì)方便[7]。隨著現(xiàn)代化藏豬養(yǎng)殖生產(chǎn)技術(shù)的提高，為有效控制疫病傳播、降低飼養(yǎng)公豬的費(fèi)用、提高豬群品質(zhì)，解決藏豬精液的妥善保存問(wèn)題，人工授精技術(shù)服務(wù)于藏豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展已迫在眉睫。任子利等[7]研究了維生素C對(duì)藏豬精液4℃保存及其精子全基因組DNA甲基化的影響。本研究擬在此研究的基礎(chǔ)上，在改進(jìn)的豬精液低溫稀釋液為基礎(chǔ)液中，每1 000 mL添加半胱氨酸0、0.02、0.04、0.06、0.08 g，將藏豬種公豬新鮮精液做4倍稀釋后于4℃環(huán)境保存至第5天，以藏豬精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率為評(píng)價(jià)精液品質(zhì)指標(biāo)，以超氧化物歧化酶（Superoxidas dismutase,SOD）活性和丙二醛（Maleic dialdehyde,MDA）含量為評(píng)價(jià)抗氧化保護(hù)作用指標(biāo)，探討半胱氨酸對(duì)4℃藏豬精液品質(zhì)的影響。以期為藏豬精液低溫保存的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)地點(diǎn) 試驗(yàn)藏豬為3～5歲健康種公豬6頭。試驗(yàn)時(shí)間為2015年5—7月，試驗(yàn)地點(diǎn)為西藏工布江達(dá)縣錯(cuò)高鄉(xiāng)某藏豬養(yǎng)殖專業(yè)合作社、西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所和西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院。

1.1.2 主要設(shè)備與試劑 動(dòng)物電刺激采精儀（MDW-1，成都華智開物科技有限公司），倒置熒光顯微鏡（IX73，奧林巴斯），電熱恒溫水槽（DKB-450A，上海森信），變頻冰箱（BCD-649WDVC，海爾），-80℃冰箱（MDF-U33V，合肥榮事達(dá)三洋電器股份有限公司）。

半胱氨酸（Sigma公司）、考馬斯亮藍(lán)（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、Diff-Quik Stain染液（北京普博斯）、亞衛(wèi)精液稀釋粉（丹麥）、速眠新Ⅱ（吉林省敦化市圣達(dá)動(dòng)物藥品有限公司）、SOD試劑盒和MDA測(cè)定試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

新鮮藏豬精液由西藏工布江達(dá)縣錯(cuò)高鄉(xiāng)某藏豬養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 改進(jìn)的低溫稀釋液配制 參照孫時(shí)軍等[8]的試驗(yàn)結(jié)果，使用亞衛(wèi)牌精液稀釋劑作為基礎(chǔ)稀釋劑，在稀釋后的精液中加入1%乙二醇作為低溫保護(hù)劑。

1.2.2 精液采集及處理 采用速眠新Ⅱ（0.1 mL/kg）肌內(nèi)注射麻醉健康藏豬種公豬，用動(dòng)物電刺激采精儀于3 V、50 mA條件下電刺激法采集健康藏豬精液。

將藏豬精液（精子活力0.8以上）做4倍稀釋，用6層以上紗布包裹后放入培養(yǎng)箱中，17℃平衡2 h后，放入冰箱4℃保存。

1.2.3 精子質(zhì)量評(píng)價(jià) 精子活力和精子畸形率兩項(xiàng)精液常規(guī)性狀參照世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)（WHO）[9]的方法測(cè)定，具體方法如下。

精子活力：精液過(guò)濾后立即在顯微鏡下觀察精子活力，采用百分制法，直線前進(jìn)精子數(shù)占總精子數(shù)的百分比為精子活力。

精子畸形率：采用龍膽紫酒精溶液染色法，將精子涂片染色，在400倍顯微鏡下觀察，計(jì)算不同視野500個(gè)精子中畸形精子占比例即為畸形率（取3次計(jì)算的平均值）。

精子頂體完整率和精子質(zhì)膜完整率兩項(xiàng)精液性狀參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行評(píng)價(jià)。精子頂體完整率：考馬斯亮藍(lán)R250染色法。精子質(zhì)膜完整率：低滲腫脹試驗(yàn)—HOST。

1.2.4 精液抗氧化指標(biāo)的測(cè)定 超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量的測(cè)定，使用SOD試劑盒和MDA測(cè)定試劑盒，采用比色法測(cè)定精漿和精子中總SOD的活性及MDA含量。具體方法參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 半胱氨酸對(duì)4℃保存藏豬精液品質(zhì)的影響試驗(yàn)分5組，在改進(jìn)的豬精液低溫稀釋液為基礎(chǔ)液中，每1 000 mL添加半胱氨酸0、0.02、0.04、0.06、0.08 g，將藏豬種公豬新鮮精液做4倍稀釋后于4℃保存到第5天時(shí)以藏豬精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探討半胱氨酸對(duì)4℃保存藏豬精液品質(zhì)的影響。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 半胱氨酸對(duì)4℃保存藏豬精液抗氧化保護(hù)作用的影響 試驗(yàn)分組同1.3.1。每次采精后收集精液，取10 mL鮮精液于玻璃離心管中，在4 000 r/min離心分離15 min，取精漿分裝于2 mL塑料離心管，置-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜诰珴{生化參數(shù)及抗氧化指標(biāo)的測(cè)定。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行前期處理，再用SPSS 11.5軟件進(jìn)行One-Way ANOVA方差分析，并進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，檢驗(yàn)誤差為5%和1%。

2 結(jié)果與分析

2.1 半胱氨酸對(duì)4℃保存藏豬精液品質(zhì)的影響

由表1可以看出，6頭3～5歲健康種公豬精液4℃保存到第5天時(shí)，0.06 g/L半胱氨酸添加組的精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率這4個(gè)指標(biāo)均極顯著好于其他組（P＜0.01）。

表1 半胱氨酸對(duì)4℃保存藏豬精液品質(zhì)的影響（n=18）

2.2 半胱氨酸對(duì)4℃保存藏豬精液抗氧化保護(hù)作用的影響

由圖1和圖2可以看出，藏豬精液4℃保存到第5天時(shí)，0.06 g/L半胱氨酸添加組的精漿超氧化物歧化酶活力含量均顯著好于其他試驗(yàn)組（P＜0.05），0.08 g/L半胱氨酸添加組的精漿丙二醛含量均顯著好于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，0.08 g/L半胱氨酸添加組精子超氧化物歧化酶活力最高，各組間差異不顯著，精子丙二醛含量0.06 g/L半胱氨酸含量最高。

圖1 半胱氨酸對(duì)4℃保存藏豬精漿SOD活力和MDA含量的影響

圖2 半胱氨酸對(duì)4℃保存藏豬精子SOD活力和MDA含量的影響

3 討論

谷胱甘肽和半胱氨酸能有效阻止冷凍解凍中過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的活力喪失[2]，谷胱甘肽和半胱氨酸都可以提高豬精液的液態(tài)保存效果。使用亞衛(wèi)牌精液稀釋劑作為基礎(chǔ)稀釋劑，在稀釋后的精液中加入1%乙二醇作為低溫保護(hù)劑，在改進(jìn)的豬精液稀釋液中添加0.06 g/L半胱氨酸后將藏豬種公豬精液做4倍稀釋，可以明顯改善藏豬精液4℃保存的效果，對(duì)高海拔地區(qū)藏豬精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率為優(yōu)；同時(shí)可明顯提高4℃保存對(duì)藏豬精液抗氧化保護(hù)作用，本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在豬精液低溫稀釋液中添加半胱氨酸，精子超氧化物歧化酶活力有所提高，但差異不顯著。這說(shuō)明半胱氨酸作為細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽生物合成的前體對(duì)維持精子各項(xiàng)生理指標(biāo)[1]，抵抗DNA損傷有很明顯的效果。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，使用亞衛(wèi)牌精液稀釋劑作為基礎(chǔ)稀釋劑，在稀釋后的精液中加入1%乙二醇作為低溫保護(hù)劑，在改進(jìn)的豬精液稀釋液中添加0.06 g/L半胱氨酸后將藏豬種公豬精液做4倍稀釋，可以明顯改善藏豬精液4℃保存的效果，同時(shí)可明顯提高4℃保存對(duì)藏豬精液抗氧化保護(hù)作用。本試驗(yàn)研究將為藏豬精液低溫保存的生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

[1]Meister A,Tate S S.Glutathione and related gamma-glutamyl compounds:biosynthesis and utilization[J].Annu Rev Biochem, 1976,45:559-604.

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[5]孫琪.不同抗氧化劑對(duì)豬精液常溫保存的影響[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[6]馬乃祥.豬高效精液稀釋液研究與應(yīng)用效果評(píng)價(jià)[D].海口：海南大學(xué)，2013.

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[11]白小龍.飼糧添加不同類型油脂對(duì)種公豬及雄性SD大鼠繁殖性能的影響[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

（編輯：郭玉翠）

Effect of Cysteamine on Tibetan Boar Semen Preserved at 4℃and Antioxidative

CHENXiaoying1,MAJinying1,SONGTianzeng1,TANGJianhua2,ZHAOYanling3,RENZili3,ZHUYanbin1,WANGLiangrun4
(1.Institute of Animal Science,Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences,Lhasa 850009, China;2.The Tibet Animal Husbandry Service,Lhasa 850000,China;3.Faculty of Animal Science,Tibet Agricultural and Animal Husbandry College,Nyingchi 860000,China;4.Tibet Mulo Agricultural Sciences and Technology Co., Ltd.,Lhasa 850009,China)

This study was conducted to investigate the effects of Cysteamine on Tibetan boar semen preserved at 4℃and antioxidative.The semen was collected from Tibetan boar by electrical stimulation.Add Cysteamine 0 g,0.02 g, 0.04 g,0.06 g,0.08 g per 1 000 mL,in the improvement of pig semen low temperature dilution liquid.Save to fifth days at 4℃after dilution of fresh semen.Body integrity and membrane integrity rate of the top Tibetan pig sperm activity, sperm abnormal rate and semen quality evaluation index,to investigate the effect of Cysteamine on the quality of semen quality at 4℃,the activity of Superoxidas dismutase(SOD)and Maleic dialdehyde(MDA)were the indexes to evaluate the protective effect of antioxidation.The results show that,The sperm motility,sperm deformity rate,sperm motility rate and plasma membrane integrity rate of the Cysteamine 0.06 g/L addition group were significantly better than other test groups(P＜0.05),Seminal superoxide dismutase(SOD)activity and malondialdehyde(MDA)content were significantly better than other experimental groups(P＜0.05),added Cysteamine was in pig semen at low temperature. Also,at the same time,we found that,0.08 g/L Cysteamine supplementation group sperm superoxide dismutase(SOD) activity is the highest,But the difference was not significant between the groups.And The content of MDA in sperm was highest in 0.06 g/L group.In short,adding 0.06 g/L Cysteamine to the improved pig semen diluent and semen to do 4 times dilution,it can significantly improve the semen quality and antioxidant protection at 4℃.The experimental study laid a foundation for the production and application of cryopreservation of boar semen in the future.

Cysteamine;Tibetan pig;environmental science at 4℃;semen quality;antioxidant protection

S828

A

1002-1957(2016)06-0022-03

2016-10-05

西藏自治區(qū)2016年高校青年教師創(chuàng)新支持計(jì)劃項(xiàng)目（NO.QCZ2016-47）；西藏自治區(qū)2016年農(nóng)林業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣（農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣）項(xiàng)目“特色畜禽（藏豬）營(yíng)養(yǎng)調(diào)控研究”

陳曉英（1981-），女，甘肅武威人，助理研究員，碩士，主要從事高原畜禽繁殖技術(shù)研究工作.E-mail：chenxiaoying0891@163.com

宋天增（1980-），男，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物繁殖營(yíng)養(yǎng)調(diào)控與遺傳育種.E-mail：songtianzeng123@sina.com