GTP結合蛋白4在肝癌中的表達及作用的初步研究*

劉茂生鄭燕吳水梅李騰政鐘思思郭武華謝正元

·基礎研究·

GTP結合蛋白4在肝癌中的表達及作用的初步研究*

劉茂生①鄭燕①吳水梅①李騰政①鐘思思②郭武華①謝正元①

目的：探討GTP結合蛋白4（GTP binding protein 4，GTPBP4）在肝癌（hepatocelluar carcinoma，HCC）組織中的表達及沉默GTPBP4對人肝癌HepG2細胞增殖和周期影響。方法：收集南昌大學第二附屬醫院2014年3月至2015年2月24例新鮮臨床HCC組織及配對癌旁組織標本，采用Western blot檢測GTPBP4在組織中的表達差異；在HepG2細胞中用慢病毒介導的RNAi干擾技術沉默該基因，運用熒光顯微鏡觀察感染效率，Western blot、RT-qPCR檢測沉默效果；CCK-8實驗、流式細胞儀觀察細胞增殖、細胞周期變化。結果：1）Western blot結果顯示GTPBP4在21例（87.5％）HCC組織標本中明顯高表達（P＜0.000 1）；2）用熒光顯微鏡觀察顯示慢病毒成功感染HepG2細胞后，發現90％細胞表達GFP；LV-GTPBP4-RNAi組GTPBP4在RNA水平、蛋白水平較對照組分別下降約70％和67％；3）GTPBP4基因沉默96 h后，LV-GTPBP4-RNAi組增殖能力抑制，抑制率約54.51％；LV-GTPBP4-RNAi組G0/G1期增多，S期減少，細胞周期發生停滯。結論：GTPBP4在HCC組織中高表達，利用RNAi干擾GTPBP4基因表達后，人肝癌HepG2細胞增殖能力明顯下降，細胞周期停滯于G0/G1期，但是具體分子機制不明。

肝癌GTPBP4增殖

肝癌在我國腫瘤總體發病率為第4位，死亡率為第3位［1］，其中肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占肝癌85％～90％［2］。盡管已有大量研究闡述其分子機制，但仍有許多重要分子機制不明。GTP結合蛋白4（GTP binding protein 4，GTPBP4）是一種定位于核仁的新型G蛋白［3］，主要參與60S亞單位的合成［4］和成熟［5］，該蛋白與細胞增殖和生長密切相關。目前，對于該基因在腫瘤中的研究較少，僅少量文獻提示該蛋白和乳腺癌［6-7］、神經膠質瘤［8］等腫瘤有關。本課題組研究GTPBP4在HCC組織中的表達情況，并通過慢病毒介導的RNA干擾技術沉默基因，觀察該基因沉默對人肝癌HepG2細胞增殖、周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌HepG2細胞（購自中國凱基生物技術公司），總蛋白抽提試劑盒（購自中國北京普利萊基因有限公司），Trizol抽提試劑（購自中國全式金有限公司），RNA逆轉錄試劑盒（購自日本TAKARA公司），熒光定量試劑盒（購自日本TAKARA公司），CCK-8試劑（購自中國全式金有限公司），細胞周期試劑盒（購自中國凱基生物技術公司），兔多克隆抗體GTPBP4（購自中國武漢proteintech公司），鼠多克隆抗體GAPDH（購自中國武漢proteintech公司），辣根過氧化酶標記山羊抗兔、山羊抗鼠（購自中國全式金有限公司），GTPBP4、GAPDH正反義鏈引物（購自上海生物工程設計合成），攜帶表達GFP的GTPBP4小干擾RNA的重組慢病毒（LV-GTPBP4-RNAi）（由上海吉凱公司篩選、構建并包裝），胎牛血清（購自中國Gibco公司）。

1.2 方法

1.2.1 新鮮組織收集南昌大學第二附屬醫院2014年3月至2015年2月肝膽外科行肝癌切除術，在未影響病理診斷前提下，于離體半小時內取癌組織、距癌旁至少2 cm以上肝組織小塊狀標本，液氮運輸并凍存于-80℃冰箱中。收集標本均取得患者或家屬同意并簽署知情同意書。該研究獲得醫院倫理委員會批準。新鮮組織納入后續實驗標準：病理類型必須為HCC，膽管細胞性肝癌、混合型肝癌及轉移性肝癌不納入本實驗。所有納入患者術前未接受任何放化療、介入手術等治療。共收集符合標準24例標本，其中男性21例，女性3例；年齡34～76歲，平均年齡（54.0±10.7）歲；HBsAg陽性19例；腫瘤直徑1.5～18cm，直徑≥5 cm 13例；合并肝硬化10例；9例患者血清AFP＞200 ng/mL，AFP正常者7例（正常值＜8.1 ng/mL）。

1.2.2 組織總蛋白提取稱取30 mg肝細胞癌組織/癌旁組織，加入1 mL裂解液，手動勻漿研磨，加入2倍體積的抽提試劑，混勻，室溫靜置10 min，4℃1 000 r/min離心10 min，保留中間白色蛋白膜并室溫干燥，加入適量2％SDS溶解，95℃變性10 min-震蕩-室溫冷卻30min，4℃、12000r/min離心5min，取蛋白上清，定量。

1.2.3 重組慢病毒感染肝癌HepG2細胞消化重懸HepG2細胞，將3×105個細胞接種于6孔板內，待細胞融合度達40％～50％，分別用LV-GTPBP4-RNAi、LV-NC組感染HepG2細胞，感染復數（multiplicity of infection，MOI）為10，polybrene終濃度為5 μg/mL。12 h后更換新鮮完全培養基，72 h后用熒光顯微鏡觀察GFP表達情況，并計算慢病毒轉染效率。對照組為無關干擾片段病毒LV-Negative control（LV-NC）。LVGTPBP4-RNAi靶序列為5'-AACCGTTATTCATAAA CAT-3'，LV-NC無關序列為5'-TTCTCCGAACGTGT CACGT-3'。

1.2.4 實時熒光定量PCR慢病毒感染后第5 d，用Trizol試劑常規提取LV-GTPBP4-RNAi組、LV-NC組細胞總RNA，用核酸蛋白檢測儀檢測總RNA濃度及純度，根據TAKARA逆轉錄試劑盒說明書逐步加入逆轉錄成分及用量，逆轉錄體系為20 μL，將RNA逆轉錄成cDNA。取適量的cDNA進行下一步熒光定量，根據TAKARA熒光定量試劑盒的說明書，逐步加入成分用量，本實驗采用20 μL體系。實時熒光定量PCR反應循環設置如下：預變性1個循環（95℃預變性30 s）；40個擴增循環（95℃5 s；61℃退火30 s），進行熒光信號的采集；溶解曲線建立，采集熒光信號。GTPBP4引物正義鏈序列5'-GGACGGATGTGCACA GTGAT-3'，反義鏈5'-TCTGCTCTCGTCACCTTGTT-3'，擴增產物長度為173 bp；GAPDH引物正義鏈序列5'-GTTGGAGGTGGGAGTCAACGGA-3'，反義鏈序列5'-GAGGGATCTCGCTCCTGGAGGA-3'，擴增產物長度為240 bp。熒光定量結果按2-△△CT計算并比較兩組的mRNA表達量。

1.2.5 細胞總蛋白提取變性10 min，蛋白定量慢病毒感染后第5 d，棄培養液，預冷PBS洗滌3遍，加入細胞裂解液300 μL，冰上靜置裂解30 min用細胞刮將細胞刮下，轉移至微量離心管中；4℃12000r/min，離心15min；取上清，100℃煮沸。

1.2.6 Western blot檢測將組織、細胞總蛋白抽提后，加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮10 min，低溫冷卻，取適量進行SDS-PAGE電泳（8％分離膠、5％濃縮膠），電泳后，電轉移至PVDF膜上，室溫下用含5％脫脂牛奶封閉液封閉2 h，TBST漂洗5 min，加入一抗，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，15 min換液1次。加入二抗，室溫下孵育80 min，TBST漂洗3次，15 min換液一次，在暗室下進行化學發光、壓片、顯影、定影。應用Image J軟件測量GTPBP4、GAPDH灰度值，以GAPDH為內參，計算目的蛋白相對表達量。

1.2.7 CCK-8實驗慢病毒感染HepG2細胞后第5 d，用0.25％胰蛋白酶消化重懸細胞，調整細胞密度為2×104/mL，分別將LV-GTPBP4-RNAi、LV-NC組細胞種板于96孔板內，每孔2×103個/孔，感染后96 h每孔加入CCK-8試劑10 μL，細胞培養箱內孵育2 h，用酶標儀測定在450 nm處的OD值并記錄。

1.2.8 細胞周期實驗慢病毒感染后第7 d，胰酶消化并收集細胞，用PBS液洗滌并重懸細胞，細胞密度均調整為2×106/mL，取1 mL單細胞懸液。單細胞懸液離心去上清，加入1 mL 70％的預冷乙醇，4℃固定過夜。染色前用PBS洗滌2次，加入100μL的RNase A，37℃水浴30 min。再加入500 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液混勻，4℃避光反應30 min。用流式細胞儀檢測分析，記錄激發波長488 nm處的紅色熒光，采集并記錄各組細胞DNA數據。

1.3 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。配對樣本比較采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC組織標本GTPBP4表達情況

GTPBP4在21例（87.5％）HCC組織表達量較高，在3例HCC組織及癌旁組織表達無明顯差異，提示GTPBP4蛋白表達量在HCC組織中過表達，與癌旁組織差異明顯（圖1）。

A.Representative images showing GTPBP4 protein expression in eight paired HCC tissues and adjacent noncancerous liver tissues;B.The relative protein expression of GTPBP4 is more significantly elevated in the 24 paired HCC tissues than in adjacent noncancerous liver tissues.(***. P＜0.000 1)圖124對HCC組織及配對癌旁組織中GTPBP4蛋白表達情況Figure 1Protein expression of GTPBP4 in 24 HCC tissues compared with their adjacent noncancerous liver tissues

2.2 GTP表達

重組慢病毒感染HepG2細胞72 h后，用倒置熒光顯微鏡觀察GFP表達情況，顯示LV-GTPBP4-RNAi組、LV-NC組細胞90％以上表達陽性，感染效率高（圖2）。通過實時熒光定量PCR、Western blot在RNA水平、蛋白水平檢測表達顯示，LV-GTPBP4-RNAi組RNA水平較LV-NC組下降約70％（圖3A），蛋白水平下降約67％（圖3B），能有效沉默GTPBP4基因的表達。

2.3 細胞增殖能力

慢病毒感染HepG2細胞后，LV-GTPBP4-RNAi組、LV-NC組的平均OD值分別為0.766±0.077、1.684±0.147，抑制率約54.51％（圖4）。GTPBP4沉默后HepG2細胞增殖能力受抑制。

2.4 細胞周期變化

A.Optical microscope×100;B.Green expression×100圖2慢病毒感染72 h后，在熒光倒置顯微鏡下觀察GFP表達情況Figure 2At 72 h after lentivirus with GFP reporter infected the Hep G2 cells,GFP expression was observed under a fluorescence microscope

A.RT-qPCR analysis(***.P＜0.000 1);B.Western blot analysis圖3實驗組RNAi有效干擾沉默GTPBP4基因表達Figure 3Silencing efficiency after transfection with LV-GTPBP4-RNAi. LV-GTPBP4-RNAi effectively reduced the relative expression of GTPBP4 at both mRNA and protein levels

經慢病毒感染、胰蛋白酶消化收集細胞，用流式細胞儀檢測細胞周期發現LV-GTPBP4-RNAi組G0/ G1期增多，S期減少，細胞周期停滯在G0/G1期（圖5）。

圖4 CCK-8實驗的光密度值Figure 4Optical density was measured in cell counting kit-8 assay

A.Cell-cycle analysis was performed via propidium iodide staining;B.G0/ G1,S,and G2/M ratios in HepG2 cells.*.P＜0.01;#.P＞0.05圖5LV-NC、LV-GTPBP4-RNAi組細胞周期結果Figure 5Results of cell cycle after silencing GTPBP4

3 討論

肝癌發病隱匿，進展速度快，預后差。肝癌的外科切除、肝臟移植最為有效，但5年生存率較差，行外科切除術后，特別是合并肝硬化患者，5年再復發率或轉移達70％以上［9-10］。已有較多研究，闡述肝癌發生的分子機制并在此基礎上研發出具有前景的分子靶向藥物，且在臨床藥物驗證中取得較好效果，其中最受矚目的是多激酶抑制藥物索拉菲尼［11］。分子靶向藥物的研發開啟了治療肝癌的新大門，仍有大量的分子機制未明，進一步了解肝癌發生機制和尋找可能的藥物靶點具有重要意義。

G蛋白是指與鳥嘌呤核苷酸結合，具有GTP水解酶活性的一類信號轉導蛋白，具有結合GTP或GDP的能力、GTPase酶活性［12］，其主要分為2類［13］：1）異三聚體G蛋白，多數存在于細胞膜上，根據α亞單位不同，將G蛋白分為4類：Gs、Gi、Gq、G12；2）小G蛋白，存在于質膜或胞液中，至少細分為Ras、Rho、Rab、Arf/Sar和Ran 5個亞家族［14］。GTPBP4也稱為慢性腎功能衰竭蛋白（chronic renal failure gene protein，CRFG），GTP-binding protein NGB，NOG1，是由10號染色體長臂14-15區（10q15-14）編碼的一種由633個氨基酸組成定位于核仁的新型G蛋白，結合分子量及蛋白結構、生物學功能，發現其不屬于上述兩大類，該蛋白的GTP結合區域及序列和OBG、DRG蛋白極度相似，組成新的G蛋白亞家族，命名為ODN［3，8］。當前，對于該基因的研究較少，許多機制功能需要進一步研究，目前研究顯示該蛋白主要參與核糖體60s亞基的合成和成熟，還和腎病末期的發展有密切關系［15-16］。但是對于該基因和腫瘤的關系研究較少。

有研究發現該蛋白在神經膠質瘤細胞株中表達水平下調，轉染質粒表達上調后，施旺細胞生長、DNA合成及裸鼠成瘤能力下降，進一步研究發現，GTPBP4蛋白通過調節Merlin蛋白、Cyclin D1蛋白抑制細胞增殖，起抑癌基因角色［8］。但也有研究和上述結果相悖，乳腺癌GTPBP4表達量高者的生存期較短［6-7］，提示該蛋白可能在腫瘤分子中承擔潛在癌基因角色。此外，果蠅P53蛋白與全基因譜內的蛋白相互作用時，GTPBP4選擇性結合P53家族中P53蛋白，通過功能實驗發現細胞增殖、周期均出現不同程度的變化［17］。綜上所述，該蛋白和細胞的增殖、活力相關，但是具體的分子機制不明。國內外尚較少報道該基因在HCC組織中的具體情況，本實驗探索性研究GTPBP4在HCC組織中的表達情況，并發現GTPBP4表達水平在HCC組織中明顯偏高。對于該蛋白在HCC組織中表達上調的現象，進行后續干擾實驗，采用RNAi技術沉默GTPBP4表達后，發現HCC細胞的增殖能力明顯受到抑制，細胞周期明顯停滯，提示該基因可能通過調節增殖能力參與肝癌的發生發展。

綜上所述，GTPBP4在HCC中可能通過某種機制調控細胞周期、影響細胞增殖，促進HCC發生發展。但本研究由于樣本量較少，缺少該基因和臨床密切相關指標的關聯研究，如生存期、分化程度及血管侵襲、肝內外轉移等。此外該蛋白調控HCC細胞增殖和周期的具體分子機制不明,GTPBP4功能和小G蛋白更類似，小G蛋白中Ras、Rho家族和腫瘤關系最為密切，Ras家族可激活一系列效應酶，如Raf蛋白激酶家族、PI3K家族、PLC等，Rho家族觸發部分效應酶，如JNK、Cyclin D1、CDKI等，GTPBP4是否也通過上述效應酶調控HCC細胞增殖和周期需要更深的探討。

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（2016-07-18收稿）

（2016-10-19修回）

（編輯：周曉穎 校對：張抿）

Expression of GTPBP4 in hepatocelluar carcinoma(HCC)tissues and preliminary study on the functions of the GTPBP4 gene

Maosheng LIU1,Yan ZHENG1,Shuimei WU1,Tengzheng LI1,Sisi ZHONG2,Wuhua GUO1,Zhengyuan XIE1

Zhengyuan XIE;E-mail:xzyxzy1230@163.com
1Department of Gastroenterology,The Second Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China;2Gradual School in Medicine College of Nanchang University,Nanchang 330006,China
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81360074)

Objective:To investigate the protein expression of GTPBP4 in human hepatocelluar carcinoma(HCC)tissues and the influence of GTPBP4 silencing by siRNA on the proliferation and cell cycle of HCC cell line Hep G2.Methods:Western blot analysis was performed to observe the protein expression of GTPBP4 in 24 cases of HCC tissues compared with their adjacent noncancerous liver tissues.Lentivirus-mediated RNA interference(RNAi)was used to silence GTPBP4 expression in Hep G2,and the infection efficiency was observed under a fluorescence microscope.The silencing effect was tested by Western blot and real-time PCR.After silencing the GTPBP4 gene,cell proliferation was detected using CCK-8 assay,and the cell cycle was observed using flow cytometry.Results:(1)GTPBP4 was overexpressed in 21 cases(87.5％)of HCC tissues(P＜0.000 1).(2)After the lentivirus with GFP reporter infected the Hep G2 cells,90％of the cells showed green fluorescence.LV-GTPBP4-RNAi effectively inhibited the expression of GTPBP4 at both mRNA(70％) and protein(67％)levels.(3)The proliferation ability of the LV-GTPBP4-RNAi group significantly decreased after 96 h(inhibition rate: 54.51％).Flow cytometry showed that the LV-GTPBP4-RNAi group significantly increased at the G0/G1phase,whereas the S phase decreased and arrested at the G0/G1phase.Conclusion:GTPBP4 overexpression in HCC tissues was associated with hepatocarcinogenesis and promoted tumor cell proliferation,but the specific molecular mechanisms remain to be investigated.

hepatocellular carcinoma,GTPBP4,proliferation

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.24.836

①南昌大學第二附屬醫院消化內科（南昌市330006）；②南昌大學醫學院研究生院

*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81360074）資助

謝正元xzyxzy1230@163.com

劉茂生專業方向為肝臟疾病的基礎研究。

E-mail：596480197@qq.com