5-HT與慢傳輸型便秘相關性的研究

趙兵 孔鵬飛 吳至久 唐學貴

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5-HT與慢傳輸型便秘相關性的研究

趙兵 孔鵬飛 吳至久 唐學貴

目的通過建立大鼠慢傳輸型便秘模型，檢測便秘大鼠結腸5-HT的表達情況，探討5-HT與慢傳輸型便秘是否存在相關性。方法SD大鼠48只隨機分為4組：空白組，模型組，莫沙必利治療組，麻仁丸治療組。空白組大鼠用生理鹽水灌胃，便秘模型組和治療組大鼠用復方地芬諾酯灌胃，建立大鼠慢傳輸型便秘（STC）模型。模型建立后，治療組大鼠分別用莫沙必利、麻仁丸灌胃，觀察各組大鼠大便粒數及大便濕重。治療結束后將大鼠集體處死，取大鼠近端結腸標本，用免疫組織化學的方法檢測各組大鼠結腸5-HT的表達情況。使用彩色病理圖像分析系統對陽性表達的平均光密度值（MD）進行半定量分析。4組數據之間的比較采用方差分析。結果免疫組化結果顯示：便秘組結腸5-HT的MD值（0.453±0.028）大于空白對照組（0.148±0.011）、莫沙必利治療組（0.316±0.012）及麻仁丸治療組（0.291±0.010），t值分別為34.209、15.307、18.296，P均＜0.001，差異有統計學意義；莫沙必利治療組（0.316±0.012）和麻仁丸治療組（0.291±0.010）的MD值均大于空白對照組（0.148±0.011），t值分別為35.983、31.919，P均＜0.001，差異有統計學意義。結論便秘大鼠結腸5-HT的表達增高，可能影響腸神經傳導功能，從而導致便秘的發病。

5-HT；慢傳輸型便秘；實驗研究

便秘是由多種原因導致的大腸功能失常所致，以排便間隔時間延長，大便干結難解或雖有便意而排出困難為臨床表現的病癥。同時，便秘也是某些急慢性疾病中的一個癥狀，長時間便秘不及時治療，往往會給病人帶來痛苦和精神壓力，甚至引起嚴重后果，尤其是心腦血管意外［1］。慢傳輸型便秘（slow transit constipation，STC）是臨床上的常見病及多發病，其發病機制復雜。目前對其病因研究主要是集中在以下幾個方面：藥物的濫用、不良的生活習慣、內分泌疾病、心理因素等，而其發病機制的研究則主要集中在腸道動力、腸神經系統、胃腸神經肽、Cajal間質細胞這幾個方面［2］。其中，對腸神經遞質的研究是近年來研究慢傳輸型便秘病因的熱點方向之一。5-HT作為重要的腸神經遞質，參與了腸道的動力及感覺調節過程。為求進一步探索5-HT與慢傳輸型便秘發病之間的關系，我們設計動物實驗，建立SD大鼠慢傳輸型便秘模型，探究5-HT在STC發病過程中的作用機制。

資料和方法

一、實驗材料

（一）實驗動物

SD大鼠48只，雌雄各半，體重（200±20）g，清潔級，由川北醫學院動物實驗中心提供。

（二）實驗藥物及試劑

復方地芬諾酯（國藥準字：H41023169，河南鼎昌藥業有限公司提供）。莫沙必利（國藥準字：H20031110，成都康弘藥業集團股份有限公司提供）。麻仁丸（國藥準字：Z50020517，太極集團重慶桐君閣藥廠有限公司提供）。大鼠5-HT一抗免疫組化試劑，北京博奧森生物技術有限公司。兔SP檢測試劑盒，北京康為世紀生物科技有限公司。

（三）主要儀器

主要儀器有微波爐，切片機，-80 ℃、-20 ℃、-4 ℃低溫冰箱，電子天平，Olypmus光學顯微鏡，微量移液器，電熱恒溫水浴鍋。

二、實驗方法

（一）動物分組

48只SD大鼠，隨機分為4組：空白組、便秘模型組、莫沙比利治療組、麻仁丸治療組。

（二）動物造模

根據萬錦州等［3］復方地芬諾酯造模方法稍作改進，空白組大鼠每日給予生理鹽水0.2 mL/10 g，便秘模型組和治療組大鼠每日給予復方地芬諾酯10 mg/kg加入生理鹽水配制成混懸液灌胃，正常進水進食，連續7 d作為1個療程，連用3療程，療程間停藥1 d。第三療程末次給藥后記錄各組大鼠24 h內大便粒數和大便濕重，確定慢傳輸型便秘模型的建立。

（三）藥物治療方法

空白組，不造模，不治療；模型組，只造模，不治療。便秘模型建立成功后：莫沙必利組，按2.5 mg/kg用藥量，加入生理鹽水配制成混懸液4 mL，通過灌胃給藥，連續3 d作為1個療程，共給藥2個療程，療程間停藥1 d，整個過程正常喂食進水。麻仁丸組，按3.0 g/kg 用藥量，加入生理鹽水配制成混懸液4 mL，通過灌胃給藥，連續3 d作為1個療程，共給藥2個療程，療程間停藥1 d，整個過程正常喂食進水。

（四）標本采集

動物模型建好后，用頸椎脫臼法集體處死所有大鼠，剖腹取近端結腸6 mm～8 mm，在生理鹽水中清洗干凈，放入4%多聚甲醛中固定，室溫保存。

（五）免疫組化檢測

取組織塊，經固定后，常規石蠟包埋，4 μm切片；將組織切片放在60 ℃恒溫電烤箱中1 h后取出；切片經脫蠟水化，抗原修復：滴加3% H2O2，在37 ℃下孵育10 min，阻斷內源性過氧化物酶的活性；滴加山羊血清封閉液，在37 ℃下孵育15 min；滴加一抗（1：100），4 ℃冰箱內孵育過夜；滴加二抗（生物素標記的山羊抗兔IgG），37 ℃孵育30 min；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP），37 ℃孵育15 min；DAB顯色，在顯微鏡下掌握染色程度，自來水充分沖洗。蘇木素復染，鹽酸乙醇分化；常規脫水、透明、封片及鏡檢。

所有切片都設陰性對照（不滴加一抗，PBS代替一抗），染色陽性結果為：5-HT陽性產物呈棕褐色或棕紅色。每張切片均隨機選取5個具有代表性的高倍鏡視野（×400），用高分辨率圖像分析儀Image-Proplus 6.0提供的工具來測定各視野的平均光密度（density mean，MD）值，MD值越大說明陽性細胞越多。

三、統計學分析

用SPSS19.0 軟件對各組數據進行統計，計量資料均采用均數±標準差（±s）表示，采用ANOVA方法分析，多組均數差別的多重比較應用SLD和SNK方法，P＜0.05為差異具有統計學意義。

結 果

各組大鼠近端結腸5-HT免疫組化結果示：主要表達于大鼠結腸肌間神經叢的神經元細胞胞漿，粘膜層及粘膜下肌層也有表達，呈棕紅色。空白組大鼠神經元細胞陽性表達分布均勻；模型組與空白組相比，陽性表達較空白組增高。莫沙必利治療組、麻仁丸治療組與模型組相比，陽性表達降低，但與空白組相比，陽性表達升高（圖1～4）。

各組大鼠近端結腸5-HT表達平均光密度值（MD）統計顯示：空白組分別和便秘組（t值=34.209，P＜0.001）、莫沙必利組（t值=35.983，P＜0.001）、麻仁丸組（t值=31.919，P＜0.001）相比，其MD值低于其他各組，差異有統計學意義；便秘模型組分別和莫沙必利組（t值=15.307，P＜0.001）、麻仁丸組（t值=18.296，P＜0.001）相比，其MD值高于其他2組，差異有統計學意義；莫沙必利組和麻仁丸組的MD值比較（t值=5.488，P＜0.001），其MD值高于麻仁丸組，差異有統計學意義（表1）。

圖1 大鼠近端結腸5-HT免疫組化結果。5-HT蛋白主要表達于大鼠結腸肌間神經叢的神經無細胞胞漿，粘膜層及粘膜下肌層也有表達，呈棕紅色。圖1A 空白組結腸5-HT的表達（×400）；圖1B 便秘組結腸5-HT的表達（×400）；圖1C 莫沙必利組結腸5-HT的表達（×400）；圖1D 麻仁丸組5-HT的表達（×400）

討 論

隨著人們對慢傳輸型便秘研究的不斷深入，腸神經遞質在便秘發病機制中的作用越來越引起人們的重視。近年來，有關5-HT和便秘發病的研究逐漸增多。5-HT為一種吲哚類衍生物，又名血清素，能增強血管和平滑肌收縮。5-HT能神經元廣泛的分布于胃腸道各層組織中，能調節胃腸運動、感覺及分泌。5-HT與胃腸道受體（5-HT3、5-HT4受體）結合起作用，而通過5-HT轉運蛋白在突觸間隙的再攝取滅活。因此，5-HT的合成和釋放過程，以及受體狀態等異常都可能導致系列的臨床癥狀改變。

作為腸神經系統中的一種重要神經遞質，5-HT在引發胃腸蠕動及調節內臟感覺中起關鍵作用［4］。前期已經有部分學者研究發現，5-HT與便秘的發病存在一定的相關性。如：雷懷成等［5］研究發現運動遲緩型便秘腸神經系統5-HT免疫反應的異常變化，可能是結腸遲緩性便秘的神經病理基礎。童衛東等［6］通過免疫組化檢測慢傳輸型便秘患者乙狀結腸肌間叢一氧化氮和5-HT的變化，結果表明一氧化氮及5-HT免疫反應性增強是患者結腸傳輸減慢的神經病理基礎。Crowell MD等［7］認為腸嗜鉻細胞和5-HT的信號改變可能導致胃腸動力障礙，內臟高過敏性以及腸道分泌的異常，5-HT參與腹瀉和便秘型腸易激綜合癥，慢傳輸型便秘的病理生理過程。陸敏等［8］通過對便秘患者結腸粘膜5-HT檢測發現，便秘患者5-HT表達明顯高于對照組。Sj?lund等［9］用免疫組化的方法檢測慢傳輸型便秘患者結腸粘膜神經遞質的變化時發現，便秘組患者升結腸的5-HT陽性細胞較對照組明顯增多。Shin等［10］研究發現高選擇性5-HT4受體激動劑對慢性便秘的治療具有很高的安全性和可靠性。有學者通過臨床試驗發現5-HT4受體激動劑對功能性便秘的腸道傳輸功能具有明顯的改善作用［11］。Lee等［12］研究發現一種新型的5-HT4受體激動劑可以增強小鼠結腸運動功能。JM Hoffman等［13］研究認為激活結腸粘膜5-HT4受體能夠增強腸道的傳輸功能。

表1 組大鼠結腸免疫組化5-HT表達平均光密度值（MD）比較（±s）

表1 組大鼠結腸免疫組化5-HT表達平均光密度值（MD）比較（±s）

注：*與空白組比較t值分別為34.209、35.983、31.919，P值均小于0.001；#與便秘模型組比較t值分別為15.307、18.296，P值均小于0.001；#組間比較t值=5.488，P＜0.001

分組 例數 5-HT平均光密度值空白對照組 12 0.148±0.011便秘模型組 12 0.453±0.028*莫沙比利治療組 12 0.316±0.012*#麻仁丸治療組 12 0.291±0.010*#

本實驗研究發現，5-HT主要表達于大鼠結腸肌間神經叢的神經元細胞胞漿，粘膜層及粘膜下肌層也有表達。便秘模型組與空白組相比，陽性表達較空白組增高。經莫沙必利、麻仁丸治療后，兩治療組與模型組相比，陽性表達降低。由此，我們推斷5-HT作為重要的腸神經遞質，通過在結腸的高表達，影響腸神經傳導，從而形成結腸傳輸障礙，可能是導致便秘的作用機制之一。實驗研究的發現，為我們探索便秘的發病機制及臨床藥物治療靶點提供了新的方向。

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Experimental study on the relationship between 5-HT and slow transit constipation

Zhao Bing,Kong Pengfei,Wu Zhijiu,Tang Xuegui.Anorectal Department,The Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College,Nanchong 637000,China

Tang Xuegui,Email:txg668nc@sohu.com

ObjectiveTo detect the expression of 5-HT in the colon of rats with constipation by establishing the model of slow transit constipation(STC),and to explore the correlation between 5-HT and STC.MethodsForty-eight SD rats were randomly divided into 4 groups:blank group,model group,mosapride group,maren pill group.The rats of blank group were given normal saline by gastric irrigation,while the rats of model group and treatment groups were given diphenoxylate by intragastric administration before treated.When established the model of STC,the rats of treatment groups were respectively given mosapride,maren pills,and the stool grain and stool wet weight were observed.The proximal colons were collected.Expression of 5-HT in the proximal colon by immunohistochemistry were detected.The staining results were analyzed semi-quantitively by computerized color image analyzer as the following parameter:mean density.Data were analyzed by ANOVA.ResultsThe density means(MD)of 5-HT in the colon of model group(0.453±0.028)was greater than the control group(0.148±0.011)(t=34.209,P＜0.001),mosapride group(0.316±0.012)(t=15.307,P＜0.001),maren pill group(0.291±0.010)(t=18.296,P＜0.001),and the difference was statistically signifcant;The density means(MD)of mosapride group(0.316±0.012)(t=35.983,P＜0.001)and maren pill group(0.291±0.010)(t=31.919,P＜0.001)were higher than control group,which the difference was statistically significant.ConclusionThe increased expression of 5-HT in the colon of rats with constipation may affect on the intestinal nerve conduction function,which led to the incidence of constipation.

5-HT;Slow transit constipation;Experimental study

2016-10-17）

（本文編輯：楊明）

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2016.06.009

四川省杰出青年學術技術帶頭人后續資助計劃（No.2011JQ0052）

637000 南充，川北醫學院附屬醫院肛腸科

唐學貴，Email：txg668nc@sohu.com

趙兵,孔鵬飛,吳至久,等.5-HT與慢傳輸型便秘相關性的研究[J/CD].中華結直腸疾病電子雜志,2016,5(6):499-502.