利用AhMITEI轉座子分子標記鑒定栽培花生雜交F₁代種子真偽

尹亮++任艷++石延茂++李雙鈴++王輝++袁美

摘要：雜交育種是花生品種改良的主要方法之一，鑒定F₁代雜交種子真偽并去除假雜種是雜交育種成功的前提。本研究建立起一套在不影響花生種子活力前提下提取花生F₁代雜交種子子葉DNA，并結合Ah-MITE1分子標記鑒定技術，在播種前對花生F₁代雜交種子真偽進行鑒定的技術，顯著提高了去除假雜種的準確性，將有助于提高花生品種選育的效率。

關鍵詞：花生；種子；雜種鑒定；轉座子；AhMITE1；分子標記

中圖分類號：S565.203.7 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2015）12-0001-05

花生常規育種方法主要包括引種、系統育種、雜交育種和誘變育種等，其中雜交育種是目前最重要、最有效的育種方法。為培育適宜不同地區種植的優良花生品種，需要采用雜交轉育的方法使一些種質的優異性狀更加有效地得以利用。理論上講，通過現有的人工去雄授粉雜交技術獲得品種間真雜種F₁的概率應該很大，但在實際操作過程中，由于花生花器結構較小、母本去雄不徹底以及自交花未摘除完全等原因導致母本自交形成偽雜種的情況難以避免。隨著分子生物學技術的不斷發展，利用分子標記對雜種F₁代進行鑒定的技術已在花生育種及遺傳群體構建中得到廣泛應用，提高了育種效率。

微型反向重復轉座元件（Miniature Inverted-repeat Transposable Element， MITE）最早由Bureau等在玉米基因組中發現，后續研究證實其廣泛分布于單子葉及雙子葉植物基因附近或內部。MITE結構與非自主元件相似，具有TIR或TSD結構，但又具有反轉錄轉座元件的高拷貝性。研究發現MITE主要包括Tourist和Stowaway兩種類型，通過相應的自主轉座元件編碼的反轉錄酶識別TIR序列完成擴張。它插入位點的傾向性以及高度重復性，使其在植物基因表達調控以及遺傳進化等方面發揮了重要的作用。MITE元件是在基因組中廣泛分布的高度重復序列，其序列本身的多態性也在一定程度上反映基因組的多態性。目前，利用MITE轉座元件作為遺傳標記，已在水稻、煙草、大麥以及剪股穎等植物的遺傳分析中得到應用。在花生方面，Shirasawa等研究了AhMITE1的特征，根據其兩端序列開發了一系列AhMITE1引物，并構建了花生高密度遺傳圖譜。王潔等利用13對AhMITE1分子標記對6個花生雜交組合F.代植株進行鑒定，鑒定結果與表型鑒定結果完全符合，證實AhMITE1分子標記用于花生雜種鑒定的可靠性。王輝等利用33對AhMITE1分子標記對115份花生栽培種及高世代材料進行分析，其中31對引物獲得較好的擴增效果，每對引物可擴增1～3條帶，在所有分析材料中共擴增產生57條帶，其中多態性條帶數為54，多態性條帶比率為96.49%。這些研究結果均表明AhMITE1分子標記作為一種新型的分子標記，具有操作性強、多態性高、帶型簡單穩定等其它標記無可比擬的優點，可廣泛應用于花生品種鑒定、遺傳圖譜構建以及分子標記輔助育種等方面的研究。

目前報道的利用分子標記檢測花生雜交F₁代真偽雜種的方法均是利用F₁代植株葉片DNA進行檢測，這就要求必須將全部F₁代雜交種種植，并待出苗后方能夠進行檢測。本研究旨在建立起一套在不影響花生種子活力的前提下提取花生F₁代雜交種子子葉DNA，并結合AhMITE1分子標記鑒定技術，在播種前對花生F₁代雜交種子真偽進行鑒定的技術，以提升花生品種的選育效率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究共選用12份花生材料及以其作為親本雜交收獲的F₁代種子（表1）。上述親本及F₁代種子均收獲于山東省花生研究所萊西實驗農場。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取將12份花生親本及Fi代種子編號后，在保證不破壞種子結構的情況下用刀片分別從每個種子遠胚端切取約0.5mm厚子葉，置于對應編號的2mL離心管中，加入液氮后用研磨棒研磨成粉末。基因組DNA提取采用改良小量CTAB法。向每個裝有花生子葉粉末的離心管中加入400μL已經預熱到65℃的CTAB提取液，充分混勻后65℃水浴20min。然后加入400μL體積比為25： 24：1的酚一氯仿一異戊醇溶液或體積比為24：1的氯仿一異戊醇溶液（比較其純化效果），顛倒混勻，12000r/min離心10min后，轉移上清液到新的1.5mL離心管中。加入-20C預冷的異丙醇400μL，混勻后- 20℃沉淀20min。12000r/min離心10min后，用70%乙醇清洗，室溫干燥DNA后加入TE溶液50μL，并置于-20℃保存待用。

1.2.2 PCR擴增體系及程序 AhMITEl-PCR反應體系為10μL，含2×Taq PCR MasterMix[天根生化科技（北京）有限公司]5μL、正向和反向引物（10μmol/L）各0.4μL、DNA 20ng。PCR程序為940C預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s.72℃延伸45s，共38個循環；72℃最后延伸10min。檢測所使用的10對AhMITE1分子標記引物（表2）均來自Shirasawa等。

1.2.3 PCR擴增產物的電泳檢測 PCR產物使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳（電泳緩沖液0.5×TBE，電壓120V，時間45min），凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）觀察并拍照。

1.3 真偽雜種鑒定標準

在分子鑒定中，表現父母本雜合帶型的F₁代種子為真雜種，僅表現母本帶型的為偽雜種。endprint

2 結果與分析

2.1 DNA質量檢測

本試驗提取花生種子基因組DNA采用改良小量CTAB法，純化過程分別使用酚一氯仿一異戊醇（25： 24：1）和氯仿一異戊醇（24：1）進行純化。前者上清液加入異丙醇后析出少量沉淀，70%乙醇漂洗晾干加入TE溶液后完全溶解；而后者上清液加入異丙醇后析出大量沉淀，加入TE溶液后沉淀無法完全溶解。瓊脂糖凝膠電泳結果（圖1）顯示，酚一氯仿一異戊醇純化的DNA雜質較少，而氯仿一異戊醇純化的DNA中含有大量的蛋白質等雜質。后續試驗發現用前者DNA為模板可以成功地進行PCR擴增檢測，而用后者DNA作為模板無法進行PCR檢測，將后者DNA樣品用酚一氯仿一異戊醇重新抽提沉淀并溶解后作為模板可以正常進行PCR檢測。這是由于花生子葉中含有大量的蛋白質及脂肪等物質，單純使用氯仿一異戊醇抽提得到的DNA樣品中含有大量雜質，抑制Taq酶活性導致PCR擴增受阻，因此沒有擴增產物，而酚一氯仿一異戊醇去除蛋白質等雜質的能力更強，因此在提取花生種子DNA的過程中必須使用酚一氯仿一異戊醇進行純化。

2.2 親本間AhMITE1標記多態性分析

利用12個親本材料對本實驗室已合成的部分AhMITE1標記引物進行篩選（圖2），選取擴增條帶清晰、片段大小在100～500bp之間、父母本間存在明顯差異的共顯性標記用于F₁代雜種鑒定。分子標記篩選結果見表1。

2.3 F₁代雜交種AhMITE1標記分析

按表1所示，利用不同的AhMITE1標記引物分別對11個雜交組合的F₁代種子進行鑒定，部分鑒定圖譜見圖3。對各雜交組合的鑒定圖譜進行分析，僅表現為母本帶型的為偽雜種，表現出父母本雜合帶型的為真雜種，計算得到各雜交組合的真雜種率（表3）。其中A1、A2、A6、A8真雜種率較高，達到50%以上，其余組合真雜種率均在50%以下，A10組合真雜種率最低，僅為3.2%。本研究還對同一雙仁果中的不同籽仁進行比較，A1、A4、A6、A8、A10、A11組合雙仁果中的兩個Fi種子均表現為同樣的帶型，即同為真雜種或偽雜種；而A3、A5組合及A2、A7、A9組合分別有1個或2個雙仁果中的兩個Fi種子帶型不相同，即一個為真雜種另一個為偽雜種。這種結果可能是由于雜交前母本去雄不徹底造成的。

3 結論與討論

雜交技術在現今的花生育種以及遺傳群體構建過程中已廣泛使用，但由于各種因素影響，花生Fi代雜交種真雜種率較低。目前對花生F₁代雜交種進行鑒定的方法均使用F₁代植株葉片DNA，需要將所有雜交種子種植，待出苗后方能進行檢測。本研究采用小量CTAB法從花生種子子葉中提取DNA，在不影響種子活力的前提下提取F₁代雜交種子DNA，并結合AhMITE1分子標記鑒定技術，在播種前對雜交種子真偽進行鑒定，可以提前去除假雜種，顯著提高F₁代去雜的準確率，大大降低花生材料的取樣及種植成本。

花生子房內有一至數個胚珠，胚珠橫生。史春艷等通過對四粒紅花生雙受精過程進行觀察發現，胚珠受精的順序是從上到下，不是同時受精。這說明花生同一子房中的不同胚珠受精過程是相互獨立的。本研究重點針對同一雙仁果中不同籽仁進行分析，其中大部分雙仁果中的兩個F₁代雜交種子均同為真雜種或偽雜種，但仍有小部分雙仁果中兩個F₁代雜交種子一真一偽。這種情況可能是由于授粉前去雄不徹底等原因造成母本與父本花粉同時結合在母本柱頭上，進入子房，并分別進入不同的胚珠。因此，在對花生F₁代雜交種子進行真偽鑒定時，應對每一個F₁代雜交種子進行編號檢測。endprint