TNF-α和明膠酶在病毒性心肌炎中的動態變化

阮妙華，王丹，王凱，周愛華，褚茂平，陳其，錢燕

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 兒科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院兒童心血管科，浙江 溫州 325027）

?論 著?

TNF-α和明膠酶在病毒性心肌炎中的動態變化

阮妙華1，王丹1，王凱1，周愛華1，褚茂平2，陳其2，錢燕1

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 兒科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院兒童心血管科，浙江 溫州 325027）

目的：探討TNF-α和明膠酶MMP-2、MMP-9在病毒性心肌炎（VMC）中的動態變化及其意義。方法：6周齡近交系雄性Balb/c小鼠隨機分為對照組（n=35）和感染組（n=60），分別給予PBS和含10-5.69TCID50/mL 的CVB3液0.1 mL注射，分別在第4、第10、第21、第30天各隨機取8只小鼠處死并取血和心臟標本。Reed-Muench法測定接種病毒滴度；HE染色后光鏡觀察心肌組織病理學改變；免疫組織化學法、Western blot和實時熒光定量PCR法分別檢測心肌組織MMP-2、MMP-9蛋白及其mRNA的表達；ELISA法檢測血清TNF-α的濃度變化。結果：與對照組比較，感染組血清TNF-α濃度明顯升高（P＜0.05），心肌組織MMP-2和MMP-9蛋白及其mRNA表達均顯著增高（P＜0.05）。MMP-2、MMP-9表達與心肌病理積分、TNF-α濃度均呈正相關。結論：在小鼠CVB3心肌炎中TNF-α及其下游產物MMP-2和MMP-9水平上調，可能參與VMC的病理生理過程。

腫瘤壞死因子；基質金屬蛋白酶-2；基質金屬蛋白酶-9；病毒性心肌炎；小鼠

在兒童和成人急性心肌炎中，柯薩奇B組3型病毒（CVB3）感染最為常見，10%～20%的患者可進展至慢性心肌炎和擴張性心肌病。但是心肌炎由急性進展至慢性的發病機制，目前仍不明確[1]。近年來研究[2]表明，病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）中炎性細胞浸潤和壞死程度與炎癥因子TNF-α的水平正相關。同時，各種不同細胞模型研究[3-5]

證實，TNF-α可通過上調基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）的表達和活性參與心肌炎的病理生理過程。而MMPs成員中MMP-2和MMP-9對細胞外基質的降解作用最廣泛[6]。目前在國內外CVB3小鼠心肌炎模型中，關于急性進展至慢性的研究甚少。因此，本研究通過觀察VMC心肌組織中TNF-α以及MMP-2、MMP-9的動態變化，初步探討其在VMC病理生理變化過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒：CVB3購自山東省醫學科學院。

1.1.2 動物：Balb/c小鼠95只，4～6周齡，近交系雄性，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2003-0003。隨機分為對照組（n= 35）和感染組（n=60）。

1.1.3 試劑：兔源MMP-2多克隆抗體、HE染色試劑盒、TNF-α ELISA檢測試劑盒、即用型SABC過氧化物酶等均購自武漢博士德公司，羊源MMP-9多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，小鼠MMP-2、MMP-9、GAPDH引物及探針序列由廣州達輝生物技術有限公司合成，總RNA提取試劑、反轉錄和PCR擴增所需的酶及其他試劑購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立：感染動物模型按照Wang 等[7]的方法建立。感染組小鼠經腹腔接種含10-5.69TCID50/mL的CVB3液0.1 mL，對照組注射相同劑量PBS。

1.2.2 標本的采集：分別于接種后的第4、第10、第21、第30天各隨機取8只小鼠處死并取血測TNF-α的濃度；取心臟標本做病理組織學檢查。

1.2.3 光學顯微鏡檢查：心肌組織用10%甲醛固定、脫水、包埋、切片，HE染色后病理學檢查。采用半定量方法計算心肌病理組織學積分，即每張切片隨機取5個高倍視野，計算每個視野中炎性細胞浸潤及壞死區域面積與整個視野面積之比，無病變計0分，病變面積＜25%計1分，25%～50%計2分，50%～75%計3分，＞75%計4分。

1.2.4 血清TNF-α水平的檢測：應用雙抗體夾心ELISA法，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明進行。

1.2.5 心肌組織MMP-2、MMP-9蛋白的表達檢測：應用免疫組織化學SABC法，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明進行。

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測：按Trizol方法提取總RNA后，反轉錄合成cDNA。在20 μL的反應體系中分別加入樣本RNA 2 μg，RT butter（5×）5 μL，10 mmol dNTPs 1 μL，N9隨機引物1 μL，反轉錄酶MMLV 1 μL，RNA酶抑制劑1 μL，0.1 mol/L DTT 2 μL，加DEPC處理水到20 μL，混勻后于下列溫度反應：37 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min，滅活MMLV，產物即為cDNA。PCR擴增：在50 μL反應體系中加入cDNA 5 μL，ddH2O 32 μL，PCR buffer（5×）10 μL，熒光探針0.5 μL，Taq DNA聚合酶1 μL，dNTPs 0.5 μL，擴增條件參照說明書。數據通過儀器自帶的軟件ABI Prism 7300 SDS Software進行分析，以MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA與GAPDH的相對表達量代表MMP-2 mRNA 和MMP-9 mRNA表達水平。

1.2.7 Western blot檢測：按試劑盒說明提取蛋白質。99 ℃煮沸蛋白質樣品10 min，進行SDS-PAGE凝膠電泳和轉膜，室溫下膜浸入5%脫脂牛奶30 min，I抗MMP-2（1∶1 000稀釋）抗體、MMP-9（1∶500稀釋）抗體4 ℃過夜。TBST清洗NC膜，每次10 min，共3次。然后，NC膜浸泡于相對應的I I抗（1∶2 000稀釋），室溫孵育1～2 h，清洗后顯色。用Image J圖像分析軟件對印跡條帶進行定量分析，分別計算MMP-2、MMP-9與actin光密度的比值得到其相對表達量。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS16.0統計軟件進行分析，均以±s表示，所有數據均進行正態性檢驗和方差齊性檢驗。兩指標表達相關性采用pearson相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

感染組小鼠在接種病毒后出現體質量下降、活動減少，第5天開始出現死亡，第10天達死亡高峰，共死亡9只；對照組小鼠體質量增加，活動良好，無死亡。

2.1 心肌病理組織學改變 HE染色顯示：感染組小鼠感染第4天開始出現炎性細胞浸潤；第10天心肌細胞開始出現混濁腫脹和溶解壞死，炎性細胞呈灶狀浸潤，心肌腫脹壞死；第21天部分炎性細胞開始吸收，心肌纖維排列紊亂；第30天炎性細胞基本消失，心肌間質和血管周圍心肌纖維化明顯。正常組小鼠心肌結構完整，未見炎性細胞浸潤。感染組各時間點病理積分（正常組各時間點病理積分均為0）見圖1。

圖1 感染組小鼠心肌不同時間點病理積分比較

2.2 2組血清TNF-α濃度 感染組小鼠在感染后第4天血清TNF-α濃度為（25.91±0.55）pg/mL，與對照組的（16.16±0.17）pg/mL比較明顯升高，感染組第10天血清TNF-α濃度進一步升高，達（31.02± 0.78）pg/mL，此后，濃度呈下降趨勢，但仍高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖2。

圖2 2組血清TNF-α濃度比較

2.3 心肌組織MMP-2、MMP-9蛋白以及mRNA的表達變化 對照組小鼠中，心肌組織中MMP-9蛋白不表達，MMP-2蛋白以及mRNA弱表達。感染組第4天開始表達增加，第10天達高峰，此后表達呈下降趨勢，但與對照組比較，仍顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3-5。

2.4 相關性分析 直線相關性分析顯示MMP-2、MMP-9與心肌病理積分、TNF-α均呈正相關，見表1。

圖3 小鼠各時間點心肌組織MMP-2（A）和MMP-9（B）陽性表達面積（%）比較

圖4 小鼠各時間點心肌組織MMP-2（A）和MMP-9（B）mRNA表達比較

圖5 小鼠各時間點心肌組織MMP-2（A）和MMP-9（B）蛋白表達比較

3 討論

本實驗觀察到感染組MMP-9主要在炎性細胞以及壞死的心肌細胞中表達，對照組心肌呈陰性表達；而MMP-2在正常對照組血管內皮細胞弱陽性表達，感染組在局灶壞死部位及周圍心肌細胞上陽性表達。同時，本實驗用Western blot方法，證實MMP-2 和MMP-9的表達與免疫組織化學結果一致，均呈一過性增高，于感染第4天即開始增加，第10天達到高峰，隨后逐漸下降，30 d時仍未降到正常水平，RT-PCR檢測結果發現MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA水平也呈同步變化。

表1 各指標相關性分析（r）

MMPs是一組能特異性降細胞外基質（extracellular matrix，ECM）成分的鋅鈣依賴性蛋白水解酶家族，其正常表達對維持心肌間質膠原合成與降解代謝的動態平衡有重要的作用。MMPs通過作用于ECM，介導炎性細胞的浸潤[8-13]，參與了心血管疾病的發病機制，成為心室改建、泵功能減退的直接原因之一。明膠酶包括MMP-2和MMP-9，是目前研究的熱點[14-17]。而TNF-α是一種重要的炎性介質，通過參與免疫病理反應，從而參與VMC的病理生理過程。近年來在心臟離體組織體外培養中發現，心肌細胞、平滑肌細胞和內皮細胞都可分泌TNF-α[5]。本實驗發現，心肌炎急性期TNF-α濃度升高時，MMP-2、MMP-9的蛋白表達和mRNA水平也進行性升高；恢復期，TNF-α濃度下降時，MMP-2、MMP-9的蛋白表達和mRNA水平也呈下降趨勢。相關分析顯示，MMPs的蛋白表達與病理積分、TNF-α濃度呈正相關，這與文獻[18]報道的TNF-α是MMPs的激活劑相符，提示MMPs表達增加是VMC炎癥作用的結果。研究發現，TNF-α主要通過作用于MMP-2和MMP-9的啟動子基因，誘導MMP-2和MMP-9的活性增強、表達增加[19]；抑制TNF-α的活性，可顯著下調MMP-2和MMP-9的表達[1-3]，進一步證實TNF-α/MMP-2、9的上下通路關系。

Lin等[20]和Alexey等[21]報道，在A549細胞中，TNF-α主要通過促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）、c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和NF-κB 3條途徑上調MMP-9的表達。TNF-α/MMPs通路是否通過上述路徑參與心肌炎的病理生理機制是本課題組接下來的研究重點。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Dynamic changes of TNF-α and gelatinase on murine viral myocarditis model

RUAN Miaohua1, WANG Dan1, WANG Kai1, ZHOU Aihua1, CHU Maoping2, CHEN Qi2, QIAN Yan1.
1.Department of Pediatrics, the First Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Pediatric Cardiovascular disease, the Second Affi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To explore the dynarnic changes and its meaning of TNF-α and gelatinase on the murine viral myocarditis model.Methods: Six-week-old inbred male mice were randomly assigned to control (n=35) and myocarditis group (n=60).The myocarditis and the control groups were inoculated intraperitoneally with 0.1 mL 10-5.69TCID50/mL CVB3 or vehicle (PBS) alone respectively.Eight mice were sacrifi ced at 4th day, 10th day, 21th day and 30th day after injection.The serum content of TNF-α was measured by ELISA.The myocardial levels of MMP-2 and MMP-9 were determined by Western blot, MMP-2 mRNA and MMP-9 mRNA were measured by RT-PCR.Results: Compared with the control group, the protein and mRNA expression of MMP-2 and MMP-9 in the myocardium and the serum contents of TNF-α were significantly increased in myocarditis group (P＜0.05).Conclusion: The expression of TNF-α and its downstream production MMP-2 and MMP-9 are increased in mice with acute viral myocarditis, and it may be involved in the pathogenesis of viral myocarditis.

tumor necrosis factor; matrix metalloproteinases-2; matrix metalloproteinases-9; myocarditis; mice

R3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.12.009

2016-04-18

溫州市科技局科研基金資助項目（Y20150142）。

阮妙華（1984-），女，浙江溫州人，住院醫師，碩士。

陳其，主任醫師，Email：cqq57@126.com。