TNF-α和IL-6在鼻咽血管纖維瘤中的表達及意義

吳賢敏，葉凡，武鵬，陳曉云，林昶，廖志蘇

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 耳鼻咽喉-頭頸外科，浙江 溫州 325015；2．福建醫科大學附屬第一醫院 耳鼻咽喉-頭頸外科，福建 福州 350004）

?論 著?

TNF-α和IL-6在鼻咽血管纖維瘤中的表達及意義

吳賢敏1，葉凡1，武鵬1，陳曉云1，林昶2，廖志蘇1

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 耳鼻咽喉-頭頸外科，浙江 溫州 325015；2．福建醫科大學附屬第一醫院 耳鼻咽喉-頭頸外科，福建 福州 350004）

目的：檢測腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）在鼻咽血管纖維瘤（JNA）中的表達水平，并探討TNF-α和IL-6在JNA骨質破壞機制中的作用。方法：應用免疫組織化學法檢測TNF-α和IL-6在20例JNA患者和10例正常下鼻甲組織中的表達。結果：TNF-α和IL-6蛋白在JNA中的陽性表達率均為90.0%，明顯高于TNF-α和IL-6蛋白在下鼻甲組織中的陽性表達率（均為20.0%）（均P＜0.01）。TNF-α和IL-6蛋白的表達與JNA臨床分期無關（均P＞0.05）。結論：TNF-α和IL-6在JNA組織中表達增高，可能是參與JNA骨質破壞的影響因素。

腫瘤壞死因子α；白細胞介素-6；鼻咽血管纖維瘤

鼻咽血管纖維瘤（juvenile nasopharyngeal angiofibroma，JNA）為鼻咽部最常見的良性腫瘤，與一般纖維瘤不同，它由致密結締組織、大量的彈性纖維及血管組成，常發生于10～25歲的青年男性，又稱“男性青春期出血性JNA”。Liang等[1]研究發現其本質是血管錯構瘤。雖然JNA是良性腫瘤，但其向鄰近組織擴張生長，破壞周圍骨質，可引起嚴重的并發癥。JNA的骨質破壞機制尚未明確。最近在研究病理性骨質破壞性疾病中發現腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）和白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）與中耳膽脂瘤骨

質破壞密切相關[2-3]。JNA與膽脂瘤在骨質破壞過程中有許多相似之處，雖然它們都是良性腫瘤，但都會破壞周圍骨質向鄰近組織擴張性生長。本研究采用免疫組織化學法檢測JNA組織中TNF-α和IL-6的表達情況，探討其在JNA骨質破壞機制中的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 20例JNA標本來自2000至2012年福建醫科大學附屬第一醫院病理科，福建省耳鼻喉研究所石蠟包埋存檔蠟塊。JNA組：JNA患者標本共20例，術后病理診斷均為JNA，患者年齡范圍11～35歲，平均18.5歲，其中男20例，女0例。對照組10例下鼻甲組織術后診斷為下鼻甲慢性炎癥，患者年齡范圍18～40歲，平均25.0歲，其中男5例，女5例。標本來自2015年3月至6月溫州醫科大學附屬第一醫院耳鼻咽喉科，在內窺鏡下取鼻中隔偏曲伴下鼻甲肥大患者的下鼻甲組織。標本都是24 h內取材，用4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片。

1.2 免疫組織化學染色 所用一抗濃度均為1∶100，操作嚴格按照說明書進行，步驟如下：①烤片，60 ℃，20 min；②常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水；二甲苯I 20 min，二甲苯I I 20 min，100%乙醇I 10 min，100%乙醇I I 10 min，95%乙醇5 min，80%乙醇5 min，70%乙醇5 min；③阻斷滅活內源性過氧化物酶：3% H2O237 ℃孵育10 min，PBS沖洗3×5 min；④抗原修復：置0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液（pH=6.0）中煮沸（95 ℃，15～20 min），自然冷卻20 min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫，PBS沖洗3×5 min；⑤正常羊血清工作液封閉，37 ℃ 10 min，傾去勿洗；⑥滴加一抗4 ℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3×5 min（用PBS代替一抗作陰性對照）；滴加生物素標記二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3×5 min；⑦滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3×5 min；⑧DAB/H2O2反應染色，自來水充分沖洗后，蘇木素復染，常規脫水，透明，干燥，封片。用PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性片做陽性對照。免疫組織化學染色結果判斷[4]：TNF-α和IL-6的陽性染色者細胞胞漿有棕黃色顆粒沉著；陽性細胞數：0分為無陽性細胞，1分為陽性細胞數＜25%，2分為陽性細胞數占25%～50%，3分為陽性細胞數占51%～75%，4分為陽性細胞數＞75%；染色強度：0分為無染色，1分為弱染色，2分為中等強度染色，3分為強染色。計算各抗體的陽性細胞數和染色強度得分，以3～7分為陽性。兔抗人TNF-α多克隆抗體和兔抗人IL-6多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 統計學處理方法 應用SPSS13.0統計軟件進行分析，TNF-α和IL-6的陽性表達率比較采用x2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TNF-α和IL-6在2組中的表達 TNF-α和IL-6的陽性表達顆粒主要位于JNA血管壁內皮細胞和基質成纖維細胞的胞漿中，呈棕黃色。TNF-α和IL-6在下鼻甲組織中呈弱表達或無表達，弱表達顆粒主要位于成纖維細胞胞漿、血管內皮細胞胞漿和漿液性腺體中，著色強度不一，見圖1。分別對JNA組和下鼻甲組的TNF-α和IL-6陽性表達率進行比較，JNA組中的IL-6、TNF-α表達水平明顯高于下鼻甲組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。見表1。

圖1 免疫組織化學染色結果（×400）

表1 TNF-α和IL-6在2組中的表達（例）

2.2 TNF-α和IL-6在JNA中不同臨床分期中的表達 TNF-α和IL-6在JNA不同臨床分期中的表達差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

3 討論

TNF-α具有廣泛生物學活性。TNF-α不僅有抗腫瘤、抗病毒、誘發炎癥反應等作用，還能調節機體免疫系統功能，在骨重建中也發揮重要作用。Wise 等[5]研究發現TNF-α是一種強有力的骨吸收誘導劑，調控破骨細胞的分化及其生物學活性。Nanes等[6]研究發現TNF-α具有抑制骨形成，促進骨吸收的作用，TNF-α還可間接作用于破骨細胞分化所必需的下游細胞因子，如集落刺激因子-1、IL-6，促進破骨祖細胞的增殖，抑制成骨細胞的功能。Kubota等[7]研究顯示TNF-α對核因子-κB受體活化因子配體（nuclear factor-kappa B ligand，RANKL）和護骨素（osteoprotegerin，OPG）的表達有調節作用。有研究[8]證明TNF-α刺激骨髓基質細胞表達RANKL，結合破骨細胞前體或破骨細胞表面的核因子-κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factorkappa B，RANK）后引起破骨細胞分化和活化，抑制骨形成和鈣化，進而影響骨代謝。有研究[9]發現TNF-α和RANKL可以相互作用，增強人破骨細胞活性。TNF-α促進破骨細胞的活性，特別是在炎癥狀態骨溶解中如牙周炎，促進牙槽骨破壞[10]。有研究[11]顯示在一些伴有骨質破壞的炎性關節疾病如類風濕關節炎和發生骨質溶解的患者假體周圍組織及關節液中TNF-α水平均升高。Vitale等[12]在膽脂瘤研究中發現TNF-α的表達增高，而且TNF-α的表達量與膽脂瘤骨質破壞相關。

表2 TNF-α和IL-6在不同臨床分期中的表達（例）

IL-6是細胞因子的核心成員之一，在機體的防御機制中起著不可忽視的作用。它由活化的T細胞、單核巨嗜細胞、成纖維細胞、內皮細胞以及成骨細胞等產生并作用于多種效應細胞，因此具有廣泛的生物學活性。IL-6也是破骨細胞主要的調節因子之一。首先，它可誘導骨髓單個核細胞和成骨細胞產生RANKL，在生理條件下，這些細胞中IL-6受體的表達水平較低，但在可溶性IL-6受體（SIL-6R）及信號轉導和轉錄激活因子-3（STAT-3）被激活的情況下，可引起RANKL的表達[13-16]。RANKL與其受體RANK結合后激活NF-κB、ERK1/2和p38/MAP激酶，誘導破骨細胞的成熟及其相關受體的表達[17-18]，增加破骨細胞的活性，進而引起骨丟失。其次，IL-6還能誘導一些不依賴于RANKL的促破骨細胞合成因子如IL-lB的生成。研究發現IL-lB能增加NF-κB的生成，從而影響骨代謝，而NF-κB又可反過來促進IL-6的釋放，進一步使IL-6生成增加[19-20]。已有研究[21]發現IL-6在中耳膽脂瘤中表達增高，而且表達量與聽骨鏈的破壞顯著相關。也有研究[22]證明IL-6可直接激活破骨細胞分化而產生骨質降解效應。有研究[23]報道TNF-α和IL-6在COPD患者血清中表達增高，而且它們的表達與骨吸收指標呈正相關。Murakami等[24]研究發現IL-6誘導破骨細胞的分化和活性，Tocilizumab（TCZ）-人源化抗IL-6受體抗體，抑制IL-6信號，對骨和軟骨的破壞有保護作用。本實驗結果顯示，在JNA中TNF-α和IL-6蛋白的陽性表達率均為90.0%，明顯高于它們在正常下鼻甲組織中均為20.0%的陽性表達率，二者間差異有明顯的統計學意義（P＜0.01）。但本實驗發現，TNF-α和IL-6在鼻咽血管纖維瘤中不同臨床分期中的表達差異無統計學意義（P＞0.05），我們認為TNF-α和IL-6蛋白與鼻咽血管纖維瘤的擴張性生長無顯著相關。TNF-α和IL-6在JNA組織中表達增高，IL-6是破骨細胞分化所必需的下游細胞因子，本研究推測TNF-α間接作用于IL-6，刺激破骨細胞增殖，使成骨細胞的功能受到抑制，使成骨細胞堿性磷酸酶的活性降低，參與骨質破壞。IL-6可能誘導RANKL與RANK結合，進而激活NF-κB、ERK1/2和p38/MAP激酶，誘導破骨細胞的成熟及其相關受體的表達，增加破骨細胞的活性，引起骨丟失。TNF-α和IL-6可能是參與JNA骨質破壞的影響因素，但具體機制有待進一步研究。

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（本文編輯：趙翠翠）

Expression and signifi cance of tumor necrosis factor-alpha and interleukin-6 in juvenile nasopharyngeal angiofi broma

WU Xianmin1, YE Fan1, WU Peng1, CHEN Xiaoyun1, LIN Chang2, LIAO Zhisu1.
1.Department of Otorhinolaryngology and Head and Neck Surgery, the First Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Otorhinolaryngology and Head and Neck Surgery, the First Affi liated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou, 350004

Objective: To detect the expression of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) in nasopharyngeal angiofi broma (JNA) and to explore the role of TNF-α and IL-6 in the mechnism of the bone destruction in JNA.Methods: The expressions of TNF-α and IL-6 in JNA tissue of 20 patients and normal inferior turbinate tissues in 10 cases of persons were determined by SP method of immunohistochemistry.Results: The positive expression rates of TNF-α and IL-6 proteins in JNA both were 90.0%, signifi cantly higher than those in inferior turbinate tissues which both were 20.0% (P＜0.01).The expressions of TNF-α and IL-6 protein were no correlation with the clinical stage of JNA (P＞0.05).Conclusion: The higher expressions of TNF-α and IL-6 in JNA tissues may be the infl uence factors involved in bone destruction of the JNA.

tumor necrosis factor-alpha; interleukin-6; juvenile nasopharyngeal angiofi broma

R739.63

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.12.007

2016-04-09

溫州市科技計劃項目（Y20140596）。

吳賢敏（1982-），男，浙江溫州人，主治醫師，碩士。