靶向熱休克蛋白-27基因沉默對5-氟尿嘧啶誘導SW480細胞凋亡的影響及機制

黃崇杰，劉長寶，胡萬樂，蔡錨

（溫州醫科大學附屬第二醫院 肛腸外科，浙江 溫州 325027）

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靶向熱休克蛋白-27基因沉默對5-氟尿嘧啶誘導SW480細胞凋亡的影響及機制

黃崇杰，劉長寶，胡萬樂，蔡錨

（溫州醫科大學附屬第二醫院 肛腸外科，浙江 溫州 325027）

目的：通過RNA干擾抑制熱休克蛋白-27（HSP27）基因的表達，探討沉默該基因對5-氟尿嘧啶（5-FU）誘導大腸癌SW480細胞凋亡的影響及機制。方法：將細胞分為正常對照組（Normal組）、陰性siRNA轉染組（NC組）、HSP27-siRNA轉染組（siRNA組）、單純5-FU組（5-FU組）、5-FU+陰性siRNA轉染組（NC+5-FU組）、5-FU+HSP27-siRNA轉染組（siRNA+5-FU組），通過脂質體LipofectamineTM2000將HSP27-siRNA導入SW480細胞，CCK-8法檢測靶向HSP27的siRNA和5-FU對SW480細胞增殖的抑制作用，流式細胞技術觀察轉染后細胞在5-FU作用下的早期凋亡情況，Western blot方法檢測凋亡相關蛋白Active-casepase-3、Active-caspase-9及細胞色素C（Cytc）的表達。結果：CCK-8法檢測結果顯示siRNA+5-FU組細胞增殖抑制率明顯高于同期siRNA組和5-FU組，表明聯合應用抑制率明顯升高（P＜0.05）。流式細胞儀檢測結果表明siRNA組和5-FU組均可誘導SW480細胞凋亡，兩者聯合應用細胞早期凋亡率明顯升高，與Normal組及NC組比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；Western blot檢測結果顯示siRNA+5-FU組Active-casepase-3、Active-caspase-9、Cytc蛋白相對表達水平均高于siRNA組和5-FU組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。結論：靶向HSP27-siRNA能有效抑制大腸癌SW480細胞HSP27蛋白的表達，上調Active-casepase-3、Active-caspase-9、Cytc蛋白的表達，增強5-FU誘導SW480細胞凋亡，逆轉腫瘤細胞對5-FU的耐藥。

結直腸腫瘤；熱休克蛋白-27；RNA干擾；5-氟尿嘧啶；細胞凋亡

近年來，大腸癌發病率和病死率不斷攀升，已經嚴重威脅了人類的健康。對于中晚期患者，指南上推薦以5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）為基礎的輔助化療可提高部分患者的生存期，然而腫瘤細胞耐藥是化療失敗并導致腫瘤復發的原因之一。目前大量研究表明許多因素可影響5-FU化療的敏感性，包括藥物的藥代動力學、藥物的靶點發生變化、DNA損傷修復和凋亡抑制因子高表達等[1]，但其中確切的耐藥機制仍不明確。本課題組前期研究顯示大腸癌細胞株中SW480細胞株熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）27基因呈高表達，且表達水平與5-FU的敏感性呈負相關性；HSP27-siRNA可以通過脂質體LipofectamineTM2000介導成功高效轉染SW480細胞并抑制HSP27表達[2]。所以本實驗進一步選擇SW480細胞株做為研究對象，通過RNA干擾技術抑制HSP27基因的表達，探討沉默該基因后對5-FU誘導細胞凋亡的影響及作用機制，從而為大腸癌基因治療及逆轉化療藥物耐藥提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 細胞株及主要材料 人結腸癌SW480細胞購自中科院上海分院，我院實驗室常規保存；5-FU干粉劑購自德國默克公司；RP-MI1640培養基、優化培養基OPTI-MEMI、0.05%的胰酶購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；HSP27-siRNA由上海吉瑪公司設計合成；轉染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；β-actin鼠抗人抗體、兔抗人HSP27抗體、兔抗人Active-caspase-3抗體、兔抗人Active-caspase-9抗體、兔抗人細胞色素C （Cytc）抗體購自英國Abcam公司；HRP標記的山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司；CCK-8細胞計數試劑盒購自日本同仁化學研究所；AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自中國南京凱基生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中，飽和濕度、37 ℃、5% CO2培養箱內常規傳代培養。待細胞生長至70%～90%的融合狀態用于實驗。

1.2.2 藥物配制：將10 mg的5-FU干粉劑溶于1 mL 的37 ℃ PBS溶液中，配制成104μg/mL的母液，-20 ℃冰箱保存備用；用不含血清的培養基稀釋母液，配制成終濃度為80 μg/mL的5-FU化療藥用于實驗。

1.2.3 siRNA的合成制備和細胞轉染：HSP27-siRNA由上海吉瑪制藥有限公司設計合成，陰性對照siRNA為上海吉瑪制藥有限公司提供的通用陰性對照siRNA。按照吉瑪公司提供的siRNA使用說明書及實驗指導進行，先將HSP27-siRNA及陰性對照siRNA分別溶解于RNase-free ddH2O中，配成濃度為20 μmoL/L的母液，分裝于小EP管中，-20 ℃保存備用。細胞轉染過程按照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書進行[2]。

1.2.4 CCK-8法檢測靶向HSP27的siRNA聯合5-FU 對SW480細胞增殖的抑制作用：將SW480細胞接種于96孔板，分為正常對照組（Normal）、陰性siRNA轉染組（NC）、HSP27-siRNA轉染組（siRNA）、單純5-FU組（5-FU）、5-FU+陰性siRNA轉染組（NC+5-FU）、5-FU+HSP27-siRNA轉染組（siRNA+5-FU），每組設8個復孔。轉染后6 h換液，Normal組、NC組、siRNA組換為含10%胎牛血清RPM1 1640培養液，5-FU組、siRNA+5-FU組、NC+5-FU組換為終濃度為80 μg/mL 的5-FU含藥培養基。繼續培養24、48 h，每孔加入CCK-8試劑10 μL，培養1 h后用酶標儀于450 nm波長測吸光度值（OD），以Normal組為參照組，細胞存活率為100%，計算抑制率（IR），細胞IR（%）=[1-（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（正常對照組OD值-空白對照組OD值）]×100%。實驗重復3次。

1.2.5 靶向HSP27基因沉默對5-FU誘導SW480細胞凋亡的影響及機制：將SW480細胞接種于6孔板，分為Normal、NC、siRNA、5-FU、NC+5-FU和siRNA+5-FU處理組，轉染組按前述方法進行轉染，轉染6 h后棄上清液，5-FU組加入終濃度為80 μg/mL的5-FU的含藥培養基，其余各組加入等量同種培養基，再培養24 h后進行流式細胞儀檢測早期凋亡和Western blot檢測凋亡相關蛋白的表達。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞早期凋亡：經藥物處理24 h后，用不含EDTA的胰酶消化收集上述各處理組細胞，制成單細胞懸液，離心棄上清液用PBS輕輕重懸細胞并計數1×105個細胞。按照Annexin V-FITC凋亡試劑盒說明書，對細胞進行Annexin VFITC和碘化丙啶（propidiumiodide，PI）染色。避光10 min，使用流式細胞儀進行檢測（激發波長488 nm，發射波長530 nm），每份標本收集10 000個細胞，Annexin V單陽性為早期凋亡細胞，分析軟件Cell Quest計算細胞早期凋亡率。實驗重復3次。

1.2.7 Western blot檢測Active-casepase-3、Ac-tive-casepase-9、Cytc蛋白表達：上述細胞轉染48 h后，經胰酶消化收集細胞，離心棄上清，PBS漂冼2次，用含1% PMSF的RIPA細胞裂解液裂解細胞提取總蛋白，BCA分析試劑測定樣品總蛋白濃度，調整蛋白濃度，煮沸變性10 min。每組各取100 μg總蛋白樣品，以12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。將分離的蛋白轉移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS封閉2 h。兔抗人HSP27抗體、兔抗人Activecaspase-3抗體、兔抗人Active-caspase-9抗體、兔抗人Cytc抗體（1∶500稀釋）4 ℃孵育過夜，TBST洗膜15 min，洗2次后加HRP標記的山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG（1∶500稀釋），常溫孵育2 h，TBST洗膜15 min，洗2次。用增強化學發光法顯色，X線片曝光顯影。β-actin作為內參照標化蛋白質表達。用Quantity One凝膠成像分析系統進行半定量分析。實驗重復3次。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS17.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，所有數據進行正態性及方差齊性檢驗。多組資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者采用LSD-t檢驗，方差不齊者采用Dunnett’s T3檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CCK-8法檢測靶向HSP27-siRNA和5-FU對大腸癌SW480細胞增殖的抑制作用 采用CCK-8法檢測SW480細胞增值，結果顯示，與Normal組比較，NC組作用24、48 h差異均無統計學意義（均P＞0.05），表明陰性siRNA及轉染載體對細胞無明顯毒性作用；5-FU組、siRNA組、siRNA+5-FU組SW480細胞增殖抑制率高于同期Normal組和NC組（P＜0.05），其中siRNA+5-FU組抑制率明顯高于同期siRNA組和5-FU組（P＜0.05），表明HSP27-siRNA和5-FU聯合應用其細胞抑制作用明顯增強，見表1。

表1 CCK-8法檢測細胞增殖抑制率（±s，%）

表1 CCK-8法檢測細胞增殖抑制率（±s，%）

與同一時間NC組比：aP＜0.05；與同一時間siRNA組和5-FU組比：bP＜0.05

2.2 HSP27-siRNA靶向干擾對5-FU誘導SW480細胞早期凋亡的影晌 與Normal組和NC組比較，siRNA組和5-FU組均可誘導SW480細胞凋亡（均P＜0.05）；二者聯合應用，早期凋亡率明顯增加，且大于siRNA組和5-FU組（P＜0.05）；而siRNA組、5-FU組及NC+ 5-FU組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1-2。這些結果提示HSP27-siRNA可明顯增強5-FU對SW480細胞誘導凋亡的作用。

2.3 HSP27-siRNA聯合5-FU對細胞Activecasepase-3、Active-casepase-9、Cytc凋亡相關蛋白表達的作用 除外HSP27-siRNA轉染組Activecasepase-3的表達與Normal組比較差異無統計學意義（P＞0.05），siRNA和5-FU均可促進細胞上述凋亡相關蛋白的表達，與Normal組比，差異均有統計學意義（均P＜0.05），且二者聯合應用的表達量明顯增加，大于siRNA組和5-FU組（P＜0.05），提示二者具有協同作用。而NC組及NC+5-FU組與Normal組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3和表2。

3 討論

大腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率在全球各腫瘤中位居第三，且有逐年升高的趨勢[3]。5-FU是最早于1957年由Heidelberger等合成并廣泛應用于中晚期大腸癌以及術后輔助化療的標準治療藥物，但臨床上只有部分病例對5-FU化療完全敏感，腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥是化療失敗或終止并導致腫瘤復發的主要原因之一[4]。HSP27是小分子HSP家族中的重要一員，我們在前期課題研究中，已證實HSP27在結腸癌細胞及裸鼠皮下移植瘤組織中呈高表達[5-6]。最近的蛋白質組學研究[7]表明，HSP27在結直腸癌中的過表達與化療耐藥和預后不良存在必然聯系。

RNA干擾是指在真核細胞中引入雙鏈RNA分子從而導致具有序列同源性的基因產生特異性基因沉默的現象，國外文獻[8-9]相繼報道siRNA干擾能成功靶向抑制肺癌、卵巢癌的表達。我們在前期工作中已證實HSP27-siRNA可以通過脂質體LipofectamineTM2000介導高效轉染大腸癌SW480細胞，Western blot檢測結果表明其在蛋白水平的抑制率達57.9%，本課題進一步研究表明HSP27-siRNA轉染能抑制SW480細胞增殖，同時可增強5-FU對大腸癌SW480細胞增殖的抑制作用。

圖1 各組SW480細胞AilllexinV-FITC/PI雙染法流式細胞儀檢測結果

圖2 各組SW480細胞的早期凋亡率比較

圖3 各組SW480細胞中Active-casepase-3、Active-casepase-9、Cytc蛋白的表達

誘導細胞凋亡是大多數化療藥物（如5-FU）作用的主要機制[10]。Zhang等[11]研究報道腫瘤細胞的凋亡抵抗是化療藥耐藥的重要原因，而HSP27對腫瘤細胞的保護作用，目前普遍認為是通過它的抗凋亡作用來實現的[12]。研究[13]表明Cytc的釋放是線粒體凋亡途徑的關鍵因素，釋放到胞漿中的Cytc在dATP作用下與凋亡相關因子1（apoptosis related factor，Apaf-1）結合成復合體，并激活caspase-9酶，被激活的caspase-9又能激活其他caspase如caspase-3等，從而誘導細胞凋亡。Concannon等[14]研究表明HSP27可與Cytc相螯合，阻止了Cytc介導的Apaf-1與caspase-9酶原的作用，阻止了凋亡小體復合體的形成，從而干擾caspase依賴型細胞凋亡的線粒體通路。Rocchi等[15]應用siRNA干擾前列腺癌細胞HSP27的表達可以抑制細胞的生長，并通過激活caspase-3酶進而誘導細胞凋亡。為了探討HSP27-siRNA干擾聯合5-FU對SW480細胞凋亡的作用，我們采用了流式細胞儀檢測，結果表明轉染靶向HSP27的siRNA組和5-FU組均可誘導SW480細胞凋亡，與Normal組比較差異有統計學意義；二者聯合應用，其早期凋亡率明顯增加，與單純應用比較差異無統計學意義，提示HSP27-siRNA可明顯增強5-FU 對SW480細胞誘導凋亡的作用。為了進一步研究其促凋亡機制，我們采用Western blot方法檢測凋亡相關蛋白Active-casepase-3、Active-caspase-9 及Cytc蛋白的表達，結果顯示除siRNA組Activecasepase-3的表達與Normal組比較，差異無統計學意義外，siRNA組和5-FU組均可促進細胞上述凋亡相關蛋白的表達，且二者聯合應用的表達量明顯增加，高于siRNA組和5-FU組，提示二者具有協同作用。表明靶向HSP27的siRNA干擾可通過抑制HSP27表達，減少與Cytc的結合，進而增加Active-casepase-3、Active-caspase-9的活化，從而促進5-FU誘導SW480細胞的凋亡，起到逆轉細胞耐藥的作用。

表2 各組SW480細胞凋亡相關蛋白表達檢測結果（±s）

表2 各組SW480細胞凋亡相關蛋白表達檢測結果（±s）

與Normal組比：aP＜0.05；與siRNA組、5-FU組、NC+5-FU組比：bP＜0.05

綜上所述，我們認為HSP27蛋白在大腸癌SW480細胞中的高表達與大腸癌的發生、發展及耐藥密切相關。靶向HSP27的siRNA能有效抑制大腸癌SW480細胞HSP27蛋白的表達，增強5-FU化療藥物的敏感性，通過上調Active-casepase-3、Active-caspase-9、Cytc蛋白的表達，并促進其誘導細胞凋亡，抑制細胞生長的腫瘤抑制作用。本實驗在細胞學水平上研究了靶向HSP27基因沉默對5-FU誘導大腸癌SW480細胞凋亡的影響，為今后在動物水平研究及臨床治療提供理論依據。

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（本文編輯：趙翠翠）

Effect of HSP27 gene silencing on apoptosis of SW480 cells induced by 5-FU and its mechanism

HUANG Chongjie, LIU Changbao, HU Wanle, CAI Mao.
Department of Anorectal Surgery, the Second Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To explore the effect and mechanism of 5-FU-induced apoptosis of colon cancer SW480 cells with HSP27 silenced by siRNA interference.Methods: Six groups of cells were used in this part of research, including Normal control group (Normal group), negative siRNA group (NC group), HSP27 siRNA group (siRNA group), 5-FU group, 5-FU with negative siRNA group (NC+5-FU group), 5-FU with HSP27 siRNA group (siRNA+5-FU group).HSP27-siRNA was transfected into SW480 cells by lipofectamine 2000.CCK-8 method was used to detect the siRNA targeted on HSP27 and 5-FU’s inhibition effect on SW480 cell proliferation.Early apoptotic rate was measured with fl ow cytometry technique, and Western blot analysis was applied to detect the expression of apoptosis-related protein of Active-casepase-3, Active-caspase-9 and Cytc.Results: Result detected by CCK-8 showed that the cell proliferation inhibition rate of siRNA+5-FU group was obviously higher than that of 5-FU group, which indicated that combined use of 5-FU and siRNA could signifi cantly improve the inhibition rate (P＜0.05).Result detected with fl ow cytometry (FCM) showed that both siRNA group and 5-FU group could induce SW480 cell apoptosis, and the combined use of 5-FU and siRNA could greatly improve the early apoptotic rate.Comparing the siRNA and 5-FU group with Normal and NC group, the difference had statistically signifi cant (P＜0.05).Western blot analysis showed that the expression level of Active-casepase-3, Activecaspase-9 and Cytc in combination group were higher than that of siRNA group and 5-FU group, the difference had statistically signifi cant (P＜0.05).Conclusion: HSP27-siRNA can signifi cantly inhibit HSP27 expression in SW480 cells, and improve the expression of protein Active-casepase-3, Active-caspase-9 and Cytc, then enhance the apoptosis-inducing effect of 5-FU on SW480 cells, and reverse the drug resistance of SW480 cells to 5-FU.

colorectal neoplasm; heat shock protein-27; RNA interference; 5-fl uorouracil; apoptosis

R735.34

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.12.004

2016-05-04

溫州市科技局科研基金資助項目（Y20140107）。

黃崇杰（1987-），男，浙江溫州人，住院醫師，碩士。

劉長寶，主任醫師，碩士生導師，Email：lcb@wzhealth.com。