豬孕烷X受體研究進展

謝旖,田亞南,文利新,鄔靜,周煜,黃衛梅(湖南農業大學動物醫學院,湖南長沙410128)

豬孕烷X受體研究進展

謝旖,田亞南,文利新,鄔靜,周煜,黃衛梅
(湖南農業大學動物醫學院,湖南長沙410128)

孕烷X受體(NR 1I2,pregnane X receptor,PXR)是一類配體依賴型的轉錄因子,為核受體超家族NRl I亞家族成員,由Kliewer等于1998年首次發現[1].PXR作為體內非常重要的一種外源性受體,與配體結合后可將各種結構中的外源性與內源性化合物(如臨床治療藥物、環境化合物和膽汁酸等)代謝排出體外.此外,PXR還是一種多效性基因調節蛋白,它除了能夠高效的調控異生物質代謝外,在調節動物的生理和病理過程中如炎癥反應,細胞增殖與腫瘤發生,控制致癌物導致的DNA損傷,通過表觀遺傳學機理調控基因表達等過程中也起著非常重要的作用.而近年來,豬作為臨床研究的可行動物模型正獲得廣泛關注,Pollock及其同事于2007年克隆出豬孕烷X受體(pgPXR) mRNA的全長[2].

1　pgPXR的分子生物學特性

1.1pgPXR基因組成豬PXR mRNA基因組全長約有2 469 bp,pgPXR包含9個外顯子.pgPXR外顯子長度和剪接位點位置與hPXR類似,hPXR的2-9外顯子包含一個可編碼434個氨基酸的開放閱讀框(Open reading frame,ORF),而pgPXR基因中2-9外顯子的ORF編碼421個氨基酸的多肽.雖然pgPXR與hPXR在N-末端存在14個氨基酸的大小差異,但該區域還沒被定性為重要的配體結合域或功能結合域.人類與小鼠PXR之前的研究表明,小鼠蛋白序列與人蛋白序列有77%的氨基酸序列同源性和86%的相似性,單個氨基酸差異就可改變PXR的活性,當轉基因小鼠在4個位置(R203,P205,Q404,Q407)分別引入人類殘基并結合SR12813,其作用與hPXR相似[3].而豬蛋白序列與人蛋白序列具有85%的氨基酸序列同源性和95%的相似性,且在R203,P205, Q404和Q407這4個位置包含人類殘基,這表明豬可能是研究人藥物基因組學的的較適當模型.

1.2pgPXR結構及組織分布PXR具有高度保守的結構域.N端激活功能區高度可變,包含非依賴性的轉錄激活域(activation function 1,AF-1),DNA結合域(DNA binding domain,DBD),配體結合域(Ligand binding domain,LBD).PXR的LBD非常大從而允許外源性和內源性化合物作為活化配體廣泛存在,PXR在經配體活化構象改變后與視黃醇X受體(Retinoid X receptor,RXR)形成異源二聚體參與基因轉錄調控.LBD存在物種差異,不同物種間配體激活程度存在差異.Moore等克隆pgPXR的LBD發現pgPXR與hPXR的LBD同源性為87%,pgPXR與hPXR在配體結合上具有較高的相似性[4].Ott等研究發現pgPXR能被hPXR激動劑利福平(RIF)和貫葉金絲桃素激活[5].

pgPXR基因在腎上腺,顎下淋巴節,胸腺,卵巢,子宮,氣管,膀胱,脾和間質淋巴結中表達量較低,在腎臟,肝臟,小腸和大腸組織中高表達,其中在肝臟和小腸的表達量最高.與hPXR在骨髓中特有表達不同,pgPXR在胸腺,下頜,間質淋巴結,膀胱,脾臟,睪丸,氣管,卵巢和子宮特有表達.

1.3pgPXR剪接變體選擇性剪接在核受體中十分常見,hPXR中也多有報道[6].核受體剪接變體(Splice Variants,SVs)可改變其生物學功能. pgPXR有7個SVs,除了最豐富的野生型mRNA亞型(ssPXR.1,DQ531717),ssPXR.2-ssPXR.7均是豬特有的變體,ssPXR.1-ssPXR.6(DQ531716,DQ531-718,DQ531719,DQ531720,DQ53172)由6,7,8和6a外顯子的選擇性剪接獲得,大小分別為853,670,528, 536,422 bp和411 bp.ssPXR.1被翻譯成一個含有421個氨基酸(aa)的多肽,ssPXR.2保留了完整的內含子6(144 bp),這導致371個氨基酸蛋白的移碼和截短,ssPXR.3變體有剪切的外顯子6(144 bp),生成截短的275個氨基酸的多肽,ssPXR.4同時剪切外顯子6和8,出現與ssPXR.3相似的275aa后翻譯提前終止.ssPXR.5剪切外顯子6,但保留外顯子6a 3'端的17 bp,從而生成比野生型短42aa的多肽, ssPXR.6變體剪接外顯子5和7,并獲得與預期相符的298aa的多肽.剪接外顯子2-4獲得含有外顯子3中51 bp內含子的ssPXR.7,研究表明,ssPXR.7的出現很可能是轉錄錯誤.

pgPXR轉錄剪接位置主要分布在外顯子6, 6a,7和8,而人的SVs只涉及外顯子2和外顯子5,通過外顯子之間的對比可確定人和豬PXR基因高序列保守區域,外顯子3是最保守的外顯子,具有99%的序列同一性.外顯子3編碼DBD,在人和豬PXR中均未被剪接.編碼LBD的外顯子4-8(具有82%序列同一性)和外顯子2(具有94%的序列同一性)在不同種屬中被選擇性剪接,pg?PXR SVs和hPXR SVs均主要位于LBD.在10個 hPXR轉錄物中,7個LBD存在缺失,與之相似,5個豬SVs也在LBD中參與剪接.

1.4單核苷酸多態性與剪接變體相似,豬序列變異單核苷酸多態性(single nucleotide polymor?phism,SNP)也在LBD(外顯子5),pgPXR 727bp和760 bp(密碼子169和180)上被檢測出2個同義變化的SNPs,惟一的非同義多態性變化的S178L位于PXR特有的a2螺旋上且在PXR混雜配體結合中發揮重要作用.S178L分布僅限于個別豬種,導致LBD中胸腺嘧啶/胞嘧啶替換信使密碼子178中亮氨酸與絲氨酸切換,發生極性氨基酸被非極性氨基酸取代的顯著變化,而LBD的關鍵區域中極性的改變可能影響配體的結合能力.

2　pgPXR的生物學功能

2.1藥物代謝細胞色素酶(CYP)是I相代謝酶,參與體內外源性物質的轉化,是藥物代謝的關鍵酶.PXR是藥物代謝的關鍵調控因子,pgPXR參與調控CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP17A1等細胞色素酶基因的表達.Nannelli A等通過hPXR強效激動劑RIF誘導CYP3A亞型和CYP2B在豬肝臟、腎臟和氣管中組織特異性的表達發現CYP3A22, CYP3A29和CYP3A46在豬肝中高表達,CYP2B22和CYP3As在腎臟中的表達水平較低,盡管CYP亞科在除肝以外的組織中不易被誘導[7],但CYP2B22在豬腎臟中能被RIF誘導且CYP2B22 mRNA在肺中的水平比腎臟和肝臟都要高.腎臟中CYP2B22誘導機制與在肝臟中類似,RIF激活PXR-RXR二聚體與HNF4-HNF4同源二聚體,使其結合CYP2B22啟動子中的多種反應元件,誘導CYP2B22基因轉錄[8].Xiao wen Li等報道,IFN-a、IFN-y可在轉錄水平誘導豬肝臟關鍵藥物代謝酶CYP3A29基因的表達,pgPXR先于CYP3A29被激活,pgPXR高表達能增強IFN-a、IFN-y對CYP3A29啟動子的上調,使CYP3A29酶活性升高.如果用RNA抑制劑干擾pgPXR基因表達,CYP3A29啟動子活性也無變化[9].

2.2類固醇激素代謝PXR能被許多內源性化合物如孕酮激活,導致參與類固醇相關代謝的細胞色素B5A(CYB5A)和細胞色素b5還原酶1 (CYB5R1),以及羥(17-β)4脫氫酶(HSD17B4)和視黃醇脫氫酶12(RDH12)的表達增加[10].CYP5A的增加轉變細胞色素P45017A1(CYP17A1)的活性,使CYP17A1結合細胞色素B5(CYPB5)形成孕烯醇酮,孕烯醇酮在睪丸中進一步生成雄烯酮(5α-androst-16-en-3-one,AND)前體.CYB5R,也稱為NADH-細胞色素b5的還原酶,可增強CYB5A對CYP17A1的影響[11].AND可轉換為3α-AND和3β-AND兩種16雄甾類固醇(16A),PXR介導CYB5R1增加有利于16A的合成.膽汁酸磺基轉移酶(SULT2A1)是AND磺酸結合的關鍵酶,促使70%以上的AND與磺酸結合,激活PXR可下調SULT2A1水平從而降低睪丸中AND磺酸代謝的百分比,維持睪丸中AND的水平.3-甲基吲哚(糞臭素,3MI)作為PXR拮抗劑影響PXR活性,調節CYP2B22和CYB5R1的表達,但3MI不影響16A的形成和性類固醇的產生.AND和3MI是公豬異味的主要組成部分.AND和3MI的水平成正相關.CYP2E1參與3MI的代謝,PXR下調CYP2E1的表達或直接抑制CYP2E1酶后,3MI代謝對AND呈負面影響[12-13]. 2.3血腦屏障P-糖蛋白(P-glycoprotein,AB?CB1,MDR1)是血-腦屏障中最突出的轉運蛋白,起屏障作用.MDR1和流出轉運蛋白限制治療中樞神經系統(central nervous system,CNS)疾病的藥物穿過血腦屏障滲入中樞神經系統.Bauer等的研究表明,在多藥耐藥相關蛋白2(MBP2)和谷胱甘肽轉移酶協調下PXR介導MDR1上調,影響藥物的藥代動力學和藥效學,降低藥物作用[14]. pgPXR能在豬血腦屏障細胞中功能性表達,在分子水平,配體結合引發PXR從細胞質進入細胞核,在細胞核內PXR激活I相,II相酶轉錄和III相酶轉運,從而影響許多藥物的代謝和轉運,造成嚴重的臨床后果.Ott等用hPXR配體RIF和貫葉金絲桃素,嚙齒動物PXR配體PCN激活pgPXR并誘導mRNA,蛋白表達和MDR1轉運活性.用定量PCR法檢測MDR1 mRNA,蛋白印跡檢測MDR1表達,鈣熒光素試驗檢測MDR1轉運活性.結果顯示三者同時增加,這表明pgPXR可調節轉運蛋白的轉錄和翻譯.PXR是控制藥物外排轉運的關鍵,對血-腦屏障功能的調節和CNS疾病治療具有重要的臨床意義.

3　結語

pgPXR與hPXR具有95%氨基酸序列相似性,單核苷酸多態性和選擇性剪接變體能影響pgPXR與配體結合的能力及其生物學功能,且pgPXR在配體結合上與hPXR相似性較高,這充分顯示豬可能是藥物學和毒理學研究的最適當模型.另外,研究表明,pgPXR在豬體內參與多種細胞色素酶的代謝及類固醇激素代謝,因此,進一步探討pgPXR在藥物代謝和動物營養中的作用變得極為關鍵,并可為提高動物的抗病能力和生產性能提供重要的理論依據和研究基礎.

[1]Klicwer S A,Moore Wade L,Wade L,et al.An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway[J].Cell,1998,92(1):73-82.

[2]Pollock C B,Rogatcheva M B,Schook L B.Comparative genom?ics of xenobiotic metabolism:a porcine-human PXR gene compar?ison[J].Mamm Genome,2007,18(3):210-219.

[3]Ostberg T,Bertilsson G,Jendeberg L,et al.Identification of resi?dues in the PXR ligand binding domain critical for species specif?ic and constitutive activation[J].Eur J Biochem,2002,269:4896-4904.

[4]Moore L B,Maglich J M,McKee D D,et al.Pregnane X receptor (PXR),constitutive androstane receptor(CAR),and benzoate X receptor(BXR)define three pharmacologically distinct classes of nuclear receptors[J].Mol Endocrinol,2002,16:977-986.

[5]Ott M,Fricker G,Bauer B.Pregnane X receptor(PXR)regulates P-glycoprotein at the blood-brain barrier:fimctional similarities between pig and human PXR[J].J Pharmacol Exp Ther,2009, 329(1):141-149.

[6]Fukuen S,Fukuda T,Matsuda H,et al.Identification of the novel splicing variants for the hPXR in human livers[J].Biochem Bio?phys Res Commun,2002,298:433-438.

[7]Lohr J W,W illsky G R,Acara M A,et al.Renal drug metabo?lism.Pharmacol[J].Rev,1998,50:107-135.

[8]Nannelli A,Chirulli V,Longo V,et al.Expression and induction by rifampicin of CAR-and PXR regulated CYP2B and CYP3A in liver,kidney and airways of pig[J].Toxicology,2008,252(1-3): 105-112.

[9]Xiaowen Li,Xiue J,Xiaoqiao Z,et al.Dingren B Pregnane X re?ceptor is required for IFN-a-mediated CYP3A29 expression in pigs[J].Biochemical and Biophysical Research Communications, 2014,445:469-474.

[10]Gray M A,Squires E J.Effects of nuclear receptor transactivation on steroid hormone synthesis and gene expression in porcine Ley?dig cells[J].J Steroid Biochem MolBiol,2013,133:93-100.

[11]M J Billen,E J Squires.The role of porcine cytochrome b5A and cytochrome b5B in the regulation of cytochrome P45017A1 activi?ty,Journal of Steroid[J].Biochemistry and Molecular Biology, 2009,113:98-114.

[12]E Doran,F W Whittington,J D Wood,et al.Cytochrome P450IIE1(CYP2E1)is induced by skatole and this induction is blocked by androstenone in isolated pig hepatocytes[J].Chemico-Biological Interactions,2002,140:81-92.

[13]W S Tambyrajah,E Doran,J D Wood,et al.The pig CYP2E1 promoter is activated by COUP-TF1 and HNF-1 and is inhibited by androstenone[J].Archives of Biochemistry and Biophysics,2004, 431:252-260.

[14]Bauer B,Hartz A M,Lucking J R,et al.Coordinated nuclear re?ceptor regulation of the efflux transporter,Mrp2,and the phase-II metabolizing enzyme,GSTpi,at the blood-brain barrier[J].J Cereb Blood Flow Metab,2008,28:1222-1234.

S858.28文獻標志碼:A

0529-6005(2016)02-0063-03

2015-04-15

謝旖(1991-),女,碩士生,研究方向為動物非傳染性群發病與動物保健,E-mail:xieyini1991happy@163.com

田亞南,E-mail:yanantian@gmail.com