環導等溫擴增（LAMP）技術在奶牛常見疾病診斷中的應用

楊　柳，陳宇飛（吉林工商學院食品工程學院，吉林長春130507）

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環導等溫擴增（LAMP）技術在奶牛常見疾病診斷中的應用

楊柳，陳宇飛
（吉林工商學院食品工程學院，吉林長春130507）

奶牛養殖業作為新興產業和朝陽產業，得到了快速發展，與此同時，奶牛各類疾病發病率尤其是普通病的發病率居高不下，嚴重影響著我國奶牛業的健康發展和乳品安全。徐孝宙等[1]對奶牛的疾病進行調查研究，發現乳房炎、子宮內膜炎、腐蹄病發病率高，為奶牛3大常見疾病。王君偉等[2]研究發現，在各種奶牛傳染病中，布病（布魯菌病）與結核病危害最為嚴重。

目前，奶牛疾病診斷常用的方法有細菌分離及生化鑒定法、免疫膠體金法等傳統檢測方法和PCR分子生物學檢測法[3-5]。傳統的細菌分離及生化鑒定法培養要求高，診斷難度大，所需時間長；RCR檢測方法雖然敏感度較高，但是需要依賴昂貴復雜的精密儀器，難以在條件較差的基層推廣普及應用[6]。因此，建立一種快速、簡便、準確的奶牛疾病診斷技術十分重要。

本文針對環介導等溫擴增技術在奶牛5種常見疾病診斷中的應用情況進行綜述，分析環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術在奶牛常見疾病診斷中應用的優勢，旨在為LAMP技術在奶牛疾病診斷中更深入的應用提供一定的參考。

1　環介導等溫擴增技術簡介

環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal am?plification，LAMP）是Notomi等在2000年建立的一種新的體外擴增特異DNA片段的分子生物學技術[7]。

LAMP技術是在65℃恒溫條件下進行核酸快速擴增，利用兩條特異性內引物和兩條特異性外引物識別靶基因上的六個區域，其DNA聚合酶具有鏈置換活性，幾十分鐘即可完成核酸擴增[8]。

2　LAMP技術在奶牛常見疾病診斷中的應用

2.1乳房炎診斷奶牛乳房炎是世界奶牛養殖業中發病率最高、流行最快，造成損失最大的疾病之一，在奶牛泌乳期發病率高達78%以上[9]。該病是由奶牛乳腺組織受到物理、化學、微生物刺激所發生的一種炎性反應。主要影響奶牛泌乳機能，可導致產奶量減少，乳品質下降。乳房炎的預防與治療難度很大，原因主要在于其致病菌的多樣性和易感牛、病原、環境之間的相互作用。

賀婷等[10]應用環介導等溫擴增技術，建立了鏈球菌性乳房炎LAMP可視化檢測方法，對鏈球菌檢測的敏感性最高達到52 fg/μf，是普通PCR方法的10倍。

彭清潔等[11]以FIP、BIP為內引物，以F3、B3為外引物對牛支原體DNA進行恒溫擴增，建立了牛支原體引起奶牛乳房炎的環介導等溫擴增方法，給牛支原體病的臨床診斷帶來了極大的方便。

2.2子宮內膜炎診斷奶牛子宮內膜炎是最常見的一種奶牛生殖器官疾病，是造成奶牛不孕不育的主要因素之一，是降低奶牛飼養戶利益的重要原因，是制約奶牛事業發展的大敵。

奶牛子宮內膜炎現檢出的主要病原菌包括化膿性鏈球菌、大腸桿菌、葡萄球菌、變形桿菌、乳鏈球菌、綠膿桿菌、化膿性棒狀桿菌等。

唐婕等[12]建立了能引起多種動物，如豬、牛、羊、禽和人類感染，出現乳房炎、子宮內膜炎的化膿隱秘桿菌，曾被稱為化膿棒狀桿菌、化膿放線菌的LAMP檢測方法。

2.3腐蹄病診斷奶牛腐蹄病是一種急性高度接觸性傳染病，發生在反芻動物趾間，患有腐蹄病的奶牛通常表現為精神萎靡、食欲減退、產奶量下降，嚴重者將會面臨淘汰。奶牛腐蹄病占奶牛疾病的40%以上，患腐蹄病奶牛的淘汰率占總淘汰率的19%，因此加強該病的預防尤為重要[13]。

多數學者認為，奶牛腐蹄病的主要病原體是壞死桿菌和節瘤擬桿菌，該病的發生主要是由壞死桿菌和節瘤擬桿菌共同感染而引起的[14]。

Sun[15-17]等利用白細胞毒素基因作為擴增靶基因，建立了檢測奶牛腐蹄病壞死桿菌的環介導等溫擴增方法（Fn-LAMP）和節瘤擬桿菌環介導等溫擴增方法（Dn-LAMP）。

兩種方法不需特殊的儀器和昂貴的檢測試劑，在電子恒溫水浴鍋內1 h即可完成奶牛腐蹄病壞死桿菌和節瘤擬桿菌的檢測，結果肉眼可見。Fn-LAMP和Dn-LAMP檢測能力為1 CFU/ mL，與PCR法相比，符合率為92.0%。研究結果顯示，Fn-LAMP和Dn-LAMP給合可用于奶牛腐蹄病的流行病學調查。

2.4布魯菌病診斷布魯菌病是重要人獸共患慢性傳染病[17]，被世界動物衛生組織（OIE）列為必須通報的傳染病之一，我國將其列為二類動物疫病[2]。

許鄒亮等[18]建立了布魯菌環介導等溫擴增可視化檢測方法，該方法最低檢出限為17 fg，與B4/ B5PCR方法進行比較，這兩種方法的結果符合率為85.0%，且LAMP方法的敏感性高于B4/B5PCR。

藺國珍[19]建立了布魯菌快速檢測LAMP方法，從奶樣和血樣中檢出6個種的布魯菌病原，所能檢測出的最低限度為9 fg/μL，較PCR方法高出10倍。

2.5結核病診斷奶牛結核病是由分支桿菌屬牛分枝桿菌引起的一種慢性消耗性傳染病，由于該病也感染人，所以是人獸共患病。

陳偉[20]針對結核分枝桿菌和牛分枝桿菌共有的基因序列RV3877設計特異性引物，能檢測出結核分枝桿菌與牛分枝桿菌，并且有很高的特異性，靈敏度達到16個菌/模板。

3　LAMP技術應用于在奶牛常見疾病診斷中的優勢

3.1診斷特異性強在奶牛常見疾病診斷方面，與傳統診斷方法以及PCR檢測方法相比，LAMP技術具有了更強的特異性。主要原因是：LAMP技術是利用2對引物（內引物與外引物），與靶序列上的6個特異性部位進行準確結合發生擴增反應，如果6個區域中的任何區域與引物不匹配，則都不能進行核酸擴增。

3.2診斷靈敏度高賀婷[6]對奶牛鏈球菌性乳房炎可視化LAMP檢測方法進行研究，得出LAMP對無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌DNA檢出限依次為52.6 fg/μf，48.9 fg/μf，3.55 fg/μf，敏感性為100%。唐婕等[12]對化膿性棒狀桿菌LAMP檢測方法的研究，靈敏度在DNA水平上可達112 fg。綜合各文獻數據，可得出結論：與PCR診斷方法相比，LAMP檢測靈敏度通常是常規PCR的10～100倍。

3.3診斷速度快許鄒亮等[18]對布魯菌環介導等溫擴增方法的研究，LAMP反應在60 min完成。

綜合各文獻數據，可得出結論：LAMP技術用于奶牛疾病診斷的基本反應可以在60～90 min內完成，如果加入環引物，則能使反應時間縮短為30～45 min。

3.4診斷更便捷在LAMP檢測體系中可加入鈣黃綠素熒光染料，這樣試驗的結果即可產生綠色熒光，使得目視檢測效果好。利用LAMP技術開發配套診斷試劑盒，只需對檢測原料進行簡單的DNA提取，就可以完成直接的擴增和診斷。與PCR方法相比，LAMP診斷方法不需要購買昂貴的儀器設備，只需配一臺普通的水浴鍋，就可以完成現場檢測，特別適用于基層、農村、偏遠山區進行奶牛常見疾病的診斷。

4　結語

LAMP檢測技術非常適用于進行奶牛常見疾病的實時定性檢測。相信隨著LAMP檢測技術的不斷完善，在不久的將來，它將逐漸取代傳統的診斷方法以及PCR檢測方法，推動奶牛常見疾病診斷技術朝著更準確、更廉價、更便捷的方向發展。

參考文獻：

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[20]陳偉.結核分枝桿菌復合群多重PCR和LAMP檢測方法的建立及臨床應用[D].武漢：華中農業大學.2010.

中圖分類號：S823.8

文獻標志碼：A

文章編號：0529-6005（2016）05-0064-02

收稿日期：2015-09-10

作者簡介：楊柳（1975-），女，副教授，本科，主要從事畜產品加工及安全檢測研究，E-mail：yl0313@163.com

通訊作者：陳宇飛，E-mail：254447088@163.com