提高DNA疫苗免疫效果研究進展

史雪萍，樊曉旭

（1.青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109；2.中國動物衛生與流行病學中心 外來病研究中心，山東 青島 266032）

提高DNA疫苗免疫效果研究進展

史雪萍1，樊曉旭2

（1.青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109；2.中國動物衛生與流行病學中心 外來病研究中心，山東 青島 266032）

DNA疫苗本質上是質粒，包括真核表達載體和整合到載體上的表達特定基因的序列。DNA疫苗通過特定的遞送方式進入宿主細胞核，載體攜帶的特定抗原基因發生轉錄，mRNA隨即至細胞漿，翻譯成抗原蛋白。不同于傳統的蛋白或多肽疫苗，DNA疫苗免疫宿主后，所表達的抗原（蛋白或多肽）能夠在基質細胞（如肌肉細胞）和樹突狀細胞中表達，這些抗原經過處理，激活B淋巴細胞，誘導產生抗體，發揮體液免疫應答效應；抗原與MHC II和MHC I分子結合，經抗原遞呈細胞遞呈活化CD4+或CD8+T淋巴細胞，發揮細胞免疫應答效應；此外，轉染的質粒DNA本身同樣可能通過綁定胞漿內非特異性的DNA識別受體，激活TBK1-STING通路，產生I型干擾素，誘導產生先天性免疫反應，同時發揮佐劑效應，促進適應性免疫應答［1］。自1992年首次報道DNA疫苗研究以來，已有馬用西尼羅河熱DNA疫苗（West-Nile-Innovator）、魚用傳染性造血組織壞死病毒DNA疫苗（Apex-IHN）、犬用癌癥治療性DNA疫苗（Oncept）、提高仔豬存活率的生長激素基因治療性DNA疫苗獲得批準上市［2］。但是，在實際應用中，DNA疫苗往往因免疫效果差被廣為詬病，特別是DNA疫苗的免疫效果因不同物種而異。因此，如何提高DNA疫苗的免疫效果成為當前DNA疫苗成功應用的難點所在。文章擬從質粒的提高目的基因表達、增強質粒的遞送效果、模擬免疫佐劑效應方面，介紹提高DNA疫苗免疫效果的研究進展。

1　提高目的基因表達，增強免疫效果

在DNA疫苗的研制中，首先要考慮和選擇質粒類型及其組成，包括其中啟動子、篩選形式、復制方式，以保證質粒的產量和質量。DNA疫苗載體由負責表達轉入基因的真核區和提供選擇和復制的大腸桿菌原核區組成。其中，真核區包括了上游負責轉錄成mRNA的啟動子和下游介導mRNA剪切和多聚腺苷化的多聚腺苷信號（見中插彩版圖1）。啟動子是在外源基因轉錄過程中首先和RNA聚合酶結合的一段DNA序列，與基因的轉錄起始有關。通過比較了5種病毒和5種細胞啟動子的啟動活性發現，將不同啟動子分別插入同一載體中的熒光素酶啟動子之前，在接種質粒后，小鼠熒光素酶的表達情況有強弱之分，結果表明，他們啟動轉錄的能力各不相同，因而對外源基因表達影響很大，巨細胞病毒啟動子（CMV）較其他病毒和細胞啟動子有著更強的轉錄作用，可提高基因持續表達的時間。多聚腺苷酸信號序列多源于兔子的β球蛋白或牛生長激素基因。

在載體中，通常加入Kozak序列，該序列是位于真核生物mRNA 5’端帽子結構后面的一段核酸序列，多為“ACCACCAUGG”，該序列經胞漿中的核糖體識別，可以與翻譯起始因子結合，從而介導mRNA的翻譯，促進轉入基因進行高效翻譯。在DNA疫苗設計中，往往加入信號肽，增強抗原遞呈效果，使抗原參與到不同的分泌系統，其中，可以選擇異源的分泌信號，也可根據分泌蛋白，選擇天然的信號肽。例如，使用優化的組織型纖溶酶原激活劑（TPA）信號肽或IgE先導基因［1］。在某些DNA疫苗，使用的N-末端的泛素標簽（末端泛素殘基G76A破壞融合蛋白）促進MHC I類抗原呈遞，泛素（Ubiquitin，Ub）是一個由76個氨基酸殘基組成的蛋白質小分子，Ub與靶抗原基因的融合表達，可以使泛素化的靶抗原經蛋白酶體降解為8～10個氨基酸小肽，這些短肽被迅速加工、處理和遞呈，并刺激機體MHC I類分子限制的特異性CD8+T淋巴細胞增殖、分化，從而誘發特異性的CTL反應，達到增強DNA疫苗免疫效果的目的，但同時降低了抗體水平。在N末端插入供MHC I和MHC II類分子結合的多肽，將泛素與目的蛋白融合表達以增強細胞免疫功能，已成為核酸疫苗設計中的一條新思路。

2　增強質粒在體內的遞送效果，更好的促進機體產生免疫應答

目前，已開發了多種DNA遞送技術，包括金顆粒轟擊（基因槍），DNA無針噴射注射，DNA紋身，脂質體包裹DNA經皮電穿孔注射等。金顆粒轟擊是通過動力系統將帶有基因的金屬顆粒，以一定的速度射進細胞，由于小顆粒穿透力強，基因可直接進入基因組，從而實現穩定轉化的目的。早期研究發現，使用金粒子包裹DNA轟擊小鼠皮膚，提高了質粒的傳遞效率。DNA噴流注射裝置Biojector 2000，無需針頭，通過產生極細高壓流穿透皮膚，將液體藥物遞送至體內。狂犬病病毒核酸疫苗接種中運用了這種技術，通過在耳內面噴射DNA，相比皮下或肌肉注射細胞培養的疫苗Rabisin，可誘導產生更高滴度、更持久的病毒中和抗體。DNA紋身是另一種遞送DNA的方法，能夠促使基因在皮膚的表皮層和真皮層高效表達。這種方法相比肌肉注射DNA能夠誘導更強的特異性細胞、體液免疫應答。此外，紋身過程會導致許多輕微的機械損傷，如出血，壞死，炎癥和皮膚再生，從而非特異性的刺激免疫系統。紋身方法免疫小鼠后，表現出的炎癥反應更強烈。DNA疫苗臨床試驗主要選擇肌肉注射和皮內注射的方式［3］。但是，直接以裸DNA接種會有以下不足：僅有小部分肌細胞攝取DNA、DNA暴露與組織間的核酸酶攻擊下、DNA用量相對較大、必須加強免疫。而通過脂質體接種包被的質粒DNA，有利于抗原遞呈細胞的攝取，同時還能保護DNA免受核酸酶的攻擊。在HIV疫苗免疫獼猴實驗中，用脂質體包裹DNA免疫，要比使用5倍劑量裸DNA免疫誘導產生的ELISA抗體高10～40倍［4］。通過豬和獼猴免疫實驗進一步證實，使用電穿孔方式經皮膚免疫體積較大動物可獲得更好的體液免疫和細胞免疫效果。隨著納米技術的發展，人們使用層狀雙金屬氫氧化物二氧化硅納米顆粒包裹編碼新城疫病毒F基因的質粒DNA，相比直接肌肉注射質粒DNA，滴鼻免疫SPF雞，可達到更好的緩釋效果，同時誘導產生較強的細胞、體液、黏膜免疫反應，攻毒保護效果更佳［5］。

3　模擬佐劑效應、活化干擾素信號通路，提高疫苗免疫原性

在疫苗應用中，尤其是滅活苗、蛋白質亞單位疫苗，常添加佐劑，引起局部炎癥反應、形成緩釋效應，增強機體對抗原的免疫應答或改變免疫應答類型。目前在已批準上市的鳥用和犬用DNA疫苗中，使用了氫氧化鋁佐劑。在獲批上市的馬用WNV DNA疫苗，使用的是Meta Stim水包油佐劑［6］，但在DNA疫苗中使用氫氧化鋁佐劑的實驗研究發現，疫苗能夠顯著提高免疫小鼠的體液免疫水平，但在非人類的靈長類動物體內，這種免疫增強效果并不明顯；隨著宿主免疫機制研究的深入，人們進一步確定了免疫DNA疫苗活化的信號通路，進而提高疫苗的免疫效果。研究表明，在DNA疫苗中加入特定的CpG基序，可供宿主TLR9識別和活化，提高先天性免疫應答效果，如使用陽離子脂質體包被含有CpG基序的質粒DNA免疫后可顯著增強肺部炎癥反應［7］。在DNA疫苗免疫中，可同時使用免疫編碼“佐劑”蛋白的質粒，如編碼IL-12、RANTES、CD40、免疫刺激RNA（isRNA）等，可提高疫苗的免疫效果。用含有流感HA片段的質粒與表達MDA5的質粒共同免疫雞，可提高對H5亞型流感感染的免疫保護［8］。

目前通過使用DNA疫苗免疫基因敲除小鼠發現，TLR9、MyD88/TRIF、DAI、RIG-I和MDA5下游接頭分子IPS-1對于DNA疫苗免疫效果無影響，而小鼠分別缺失了STING、TBK1、IRF3和IFNαR2后，削弱了DNA疫苗的免疫效果。TBK1誘導產生I型干擾素包括了TLR依賴和TLR非依賴途徑。位于內質網上的STING，受到細胞質內各種dsDNA的活化，與TBK1一并從內質網重新定位至核周小泡，最終與誘導的IκB激酶（IKK-i）將IRF3和IRF7磷酸化，活化IRF3/IRF3通路，刺激產生I型干擾素［9］。如將編碼TBK-1的質粒和目的抗原質粒各50 μg肌肉注射小鼠，能夠提高惡性瘧原蟲疫苗的體液免疫效果［10］。此外，小分子血管阻斷劑（DMXAA），模擬病毒感染產物dsDNA，在無TLRs和RNA解旋酶的參與下，僅通過TBK-1-IRF3信號通路誘導I型干擾素的大量產生。無獨有偶，抗病毒成分（CMA）能夠通過STING-TBK-1-IRF3誘導產生I型干擾素。ZBP1/ DAI，稱ZBP1，Z-DNA綁定蛋白1，也稱作DAI，DNA依賴的干擾素調控因子激活劑，或DLM-1，在體外實驗中發現，該蛋白能夠直接綁定dsDNA，增強其與IRF3和TBK1的相互作用，激活DNA介導的先天性免疫反應［11］。但是，DAI作為胞內DNA識別受體其功能尚存爭議，因為DAI在DNA誘導干擾或免疫DNA質粒后仍然能夠正常的產生干擾素，DAI在人體先天性免疫信號通路中的作用需要進一步驗證。近來研究發現，AIM2（黑色素瘤2缺失蛋白）、IFI16（γ干擾素誘導蛋白16）、HMGB（高遷移率族蛋白B1）、TRIM56（三重基序蛋白56）、DDX41（為DEXDc解旋酶家族成員）、RNA聚合酶III、cGAS（環磷酸鳥苷-磷酸腺苷（cGAMP）合成酶）功能缺失會影響DNA誘導的I型干擾素的產生［12］。因此，DNA疫苗的佐劑效果主要依賴于干擾素發揮作用。

綜上，DNA疫苗作為新興的生物技術產品，其研究方興未艾，特別是目前在小鼠模型中取得了令人欣喜的結果。但在大動物中該類疫苗免疫效果往往不佳。當前，在DNA疫苗的設計和改進上，人們重點考慮的是如何提高疫苗的遞送效率、增強抗原的表達和免疫原性，盡管研發道路依舊曲折而漫長，但隨著生物技術的發展和人們認知的深入，DNA疫苗定會作為一種有力的“武器”，應用于某些疾病的治療及傳染病的控制與根除中去。

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R 392.11

A

0529-6005（2016）09-0060-03

2016-03-18

史雪萍（1972-），女，高級獸醫師，碩士，從事動物生產及動物疫病研究，E-mail：sapqdau@tom.com

樊曉旭，E-mail：fanxiaoxu@cahec.cn