非洲豬瘟的研究進展及風險分析

劉建利，李　宏，曹琛福，孫　潔，楊俊興，張彩虹，陳澤華，花群義，呂建強

（1.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心，廣東 深圳 518405；2.伊金霍洛旗獸醫局，內蒙古 鄂爾多斯 017000）

非洲豬瘟的研究進展及風險分析

劉建利1，李宏2，曹琛福1，孫潔1，楊俊興1，張彩虹1，陳澤華1，花群義1，呂建強1

（1.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心，廣東 深圳 518405；2.伊金霍洛旗獸醫局，內蒙古 鄂爾多斯 017000）

1　傳播歷史和地理分布

非洲是非洲豬瘟（ASF）的發源地，1921年肯尼亞首次報道ASF疫情。此后，ASF從非洲的東部、南部穿過非洲中部向西部蔓延到非洲絕大部分國家［1］，并且向外傳播至印度洋島。1998年傳到了馬達加斯加。2007年傳到了距馬達加斯加800公里的毛里求斯［2］。

1957年ASF第一次傳入歐洲葡萄牙后，ASF相繼在西班牙、意大利、法國、馬耳他、比利時、安道爾、荷蘭、德國、俄羅斯、烏克蘭（2012年）、白俄羅斯（2013年）［3］等國家流行暴發。2007年，處于歐亞接壤的高加索地區的亞美尼亞、格魯吉亞暴發ASF，并向鄰近的阿塞拜疆和俄羅斯聯邦車臣邊境地區、北奧賽梯、印古什共和國、奧倫堡等多地傳播。2015年OIE又報道ASF暴發于立陶宛、波蘭、拉脫維亞和愛沙尼亞。ASF已經蔓延到整個波羅的海地區。

1971年，ASF首次傳入南美洲大陸的古巴，此后多米尼加共和國、海地、巴西相繼出現ASF疫情。目前其他大陸還沒有發生疫情的報道，但有繼續向世界各國蔓延的趨勢。

2　分子流行病學

ASFV是在細胞質內復制的復雜的雙鏈DNA大病毒。ASFV基因組大小在170～192 kbp之間，編碼多達165個基因。已被鑒定的結構蛋白有28種，在被感染的巨噬細胞中能產生超過150余種蛋白質，并且這些抗原有許多具有免疫原性［4］，其中至少50種能與感染豬或康復豬的血清反應，40種能與病毒粒子相結合。

通過研究基因型差異，分析毒株在全球的分布以及流行趨勢。對B646L基因（該基因高度保守，它能編碼一個主要的結構蛋白VP72）部分測序鑒定出ASFV至少有22個基因型，且每個基因型之間差異很小，其中有20個基因型僅存在于非洲東部和南部［5］。這些在不同地理區域發現和分離到的不同的毒株的異同與3種不同的ASFV傳播途徑的存在有關。通過分析B602L開放閱讀框里面的中部可變區域CVR（如E183L編碼的P54蛋白，CP204L編碼的P30蛋白），區分出了基因型里一些亞群［6-8］。以此用來追蹤疾病的暴發。

ASFV的有些基因型僅具有地方特異性，而有些毒株卻能跨域傳播［5］。ASFV-II型基因型很可能是從莫桑比克傳到馬達加斯加，此后這個病毒在馬達加斯加一直保持其獨特的基因型［9-10］。在毛里求斯分離到的病毒也被認為是屬于另一種ASFV-II型基因型。而在非洲西部和中部分離到的所有的ASFV均屬于ASFV-I型基因型［9］。在非洲東部和南部的叢林宿主體內也能分離到相同的ASFV-I型基因型毒株［5，11］。馬拉維和贊比亞流行基因型VIII型，高加索和俄羅斯流行基因型II型。Gallardo C等［12］從4頭臨床上感染ASFV的野豬體內取樣進行遺傳特征分析，從立陶宛和波蘭得到的ASFV病毒內包含p72 II型基因型，與從歐洲東部獲得的ASFV序列具有100%的同源性。這個基因型自2007年傳入至格魯吉亞后一直流行于歐洲東部國家。

3　疫苗

2014年靳雯雯等［13］以巨細胞病毒極早期啟動子和經水泡性口炎病毒G蛋白修飾過的pFastBacI桿狀病毒為載體構建了ASFV VP73基因桿狀病毒載體疫苗，該重組桿狀病毒能夠介導ASFV VP73蛋白在哺乳動物細胞中表達。2014年Lacasta A等［14］構建DNA疫苗（編碼了3個融合在泛素中的ASFV抗原：p54、p30和胞外域血細胞凝集素），包含4 000多個質?？寺〉谋磉_文庫，每一文庫都隨機包含有一個病毒基因組的Sau3AI限制性片段。用強毒E75株攻毒用基因文庫免疫的豬場能夠獲得60%的保護率。2014年Blome S等［15］分別用佐劑PolygenTM和Emulsigen（?）-D制備ASFV病毒滅活疫苗“亞美尼亞08”，并免疫6頭斷奶仔豬，用ASFV同源強毒株攻毒，結果6頭豬都發生了嚴重的致死性的ASF，表明現代的佐劑不能提高制備的非洲豬瘟滅活疫苗的功效。

2013年Abrams C C等［16］從ASFV弱毒株OUR T88/3基因組中剔除兩個基因DP71L和DP96R，形成重組基因后的病毒OUR T88/3ΔDP2。用病毒重組體OUR T88/3ΔDP2和親代病毒OUR T88/3免疫兩組豬，然后用強毒株OUR T88/1攻毒。接種病毒重組體的一組中有4頭豬（66%）被保護，而接種親代病毒的一組的保護力為100%。從OUR T88/ 3毒株中刪除DP71L和DP96R基因能夠降低了豬對強毒株的防范能力，表明從強毒株中刪除這些基因能夠減少ASFV對家豬的毒性。2015年O′，Donnell V等［17］構建重組病毒（ASFV-G-ΔMGF），刪除了MGF360和MGF505基因的ASFV-G對豬的毒性減弱并且對其親代病毒也能產生防御保護作用。2015年O′，Donnell V等［18］構建一種重組ASFV，刪除了毒性相關基因9GL（B119L）的ASFV-G。當使用較低劑量時，該病毒對豬的毒性減弱并誘導豬對該病毒的同源病毒產生有效的保護力。

4　檢測技術

2014年曹琛福等［19］純化ASFV p54蛋白作包被抗原，建立檢測ASFV p54抗體的間接ELISA方法，結果具有良好的特異性、敏感性。2014年靳雯雯等［20］以基因工程表達的ASFV VP73蛋白作為包被抗原，建立檢測豬血清中抗ASFV VP73蛋白的抗體的間接ELISA方法。該方法對ASF標準陽性血清的檢測靈敏度可以達到1∶2 560。2014年張鑫宇等［21］純化出重組蛋白pK205R、pE183L、pA104R和pB602L，間接ELISA篩選最佳診斷抗原，發現pK205R、p54和pB602L血清學反應良好，可用于ASFV感染后早期或中后期血清學診斷。2014年張鑫宇等［22］建立ASFV p54抗體的膠體金檢測方法。顯示在ASFV感染早期，膠體金試紙優于OIE推薦間接ELISA檢測方法。2015年張彩虹等［23］以ASFV VP73融合蛋白作為抗原免疫蛋雞，制備抗非洲豬瘟病毒VP73蛋白的特異性IgY抗體。該抗體可與非洲豬瘟病毒VP73蛋白發生特異性反應，具有免疫反應原性。

2010年John McKillen等［24］建立了MGB PCR檢測方法，該方法能夠檢測全血、脾臟和肉漿里面的ASFV，其靈敏性與OIE推薦的Taq Man PCR的靈敏性相似，比OIE推薦的常規PCR靈敏性高10倍。2010年James H E等［25］針對拓撲異構酶II基因建立的檢測ASFV的環介導等溫擴增方法，最低可以檢測到330個拷貝DNA的病毒。2011年楊吉飛等［26］基于ASFV VP72基因設計引物，建立的PCR方法能夠成功擴增非洲豬瘟病毒17個分離株的基因組，其敏感性與OIE參考的方法相當。2012年崔尚金等［27］采用納米金顆粒作為熱導介子，建立ASFV的高效納米PCR檢測方法，可以同時檢測ASFV等7種病毒細菌。2013年苗富春［28］針對ASFV p72蛋白部分基因序列，采用簡并堿基提高檢測范圍建立TaqMan模式的并聯熒光定量PCR方法。檢測靈敏度均可達到103ng/ μL。2015年Grau F R等［29］建立了能同時鑒別ASFV、CSFV和FMDV的多重實時熒光PCR方法，ASFV在接種后第3天就能被檢測到，早于出現臨床癥狀2～3 d。

5　風險分析

我國尚未見有非洲豬瘟病例的報道，但ASF一旦侵入，將對我國豬及其產品的生產帶來毀滅性的打擊。從我國周邊ASF的流行狀況、ASF的傳播媒介和我國與世界交流三個方面分析，ASF傳入我國的風險性在不斷地加大。

首先處于歐亞接壤的高加索地區和俄羅斯聯邦多地已暴發ASF，我國與俄羅斯有著漫長的邊境線，存在攜帶ASFV的野豬跨境傳播病毒到我國無疫病區的可能；其次我國橫跨寒、溫、亞熱和熱帶地域，氣候條件多樣，具有ASF媒介蜱的生存條件。我國西南、華東和華中等地區為軟蜱高發生區［30］，動物與蜱接觸機會較多，具有ASF傳播的媒介條件；再者我國與世界的貿易往來和人員交流日益頻繁，很可能將污染的豬肉、豬肉制品或飼料產品通過機場、海港等渠道將ASFV帶到國內。

［1］Denis Muhangi.African swine fever：an epidemiological overview［J］.British Journal of Virology，2014，1（1）：42-47.

［2］Costard S，Wieland B，de Glanville W，et al.African swine fever：how can global spread be prevented［J］.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，2009，364：2683-2696.

［3］Sánchez-Vizcaíno J M，Mur L，Martínez-López B.African swine fever（ASF）：five years around Europe［J］.Veterinary Microbiology，2013，165：45-50.

［4］Salas M L，Andrés G.African swine fever virus morphogenesis［J］.Virus Research，2013，173：29-41.

［5］Boshoff C I，Bastos A D，Gerber L J，et al.Genetic characterisation of African swine fever viruses from outbreaks in southern Africa（1973-1999）［J］.Veterinary Microbiology，2007，121：45-55.

［6］de Villiers E P，Gallardo C，Arias M，et al.Phylogenomic analysis of 11 complete African swine fever virus genome sequences［J］.Virology，2010，400：128-136.

［7］Gallardo C，Mwaengo D M，Macharia J M，et al.Enhanced discrimination of African swine fever virus isolates through nucleotide sequencing of the p54 p72 and pB602L（CVR）genes［J］.Virus Genes，2009，38（1）：85-95.

［8］Owolodun，O A，Bastos A D，Antiabong J F，et al.Molecular characterisation of African swine fever viruses from Nigeria（2003-2006）recovers multiple virus variants and reaffirms CVR epidemiological utility［J］.Virus Genes，2010，41：361-368.

［9］Bastos A D，Penrith M L，Cruciere C，et al.Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene characterisation［J］.Archives of Virology，2003，148：693-706.

［10］Gonzague M，Roger F，Bastos A，et al.Isolation of a non-haemadsorbing，noncytopathic strain of African swine fever virus in Madagascar［J］.Epidemiology and Infection，2001，126：453-459.

［11］Lubisi B A，Bastos A D，Dwarka R M，et al.Molecular epidemiology of African swine fever in East Africa［J］.Archives of Virology，2005，150：2439-2452.

［12］Gallardo C，Fernández-Pinero J，Pelayo V，et al.Genetic variation among African swine fever genotype II viruses，eastern and central Europe［J］.Emerging Infectious Diseases，2014，20：1544-1547.

［13］靳雯雯.非洲豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測方法的建立及其桿狀病毒載體疫苗的構建［D］.武漢：華中農業大學，2014.

［14］Lacasta A，Ballester M，Monteagudo P L，et al.Expression library immunization can confer protection against lethal challenge with African swine fever virus［J］.Journal of Virology，2014，88：13322-13332.

［15］Blome S，Gabriel C，Beer M.Modern adjuvants do not enhance the efficacy of an inactivated African swine fever virus vaccine preparation［J］.Vaccine，2014，32：3879-3882.

［16］Abrams C C，Goatley L，Fishbourne E，et al.Deletion of virulence associated genes from attenuated African swine fever virus isolate OUR T88/3 decreases its ability to protect against challenge with virulent virus［J］.Virology，2013，443：99-105.

［17］O，Donnell V，Holinka L G，Gladue D P，et al.African Swine Fever Virus Georgia Isolate Harboring Deletions of MGF360 and MGF505 Genes Is Attenuated in Swine and Confers Protection against Challenge with Virulent Parental Virus［J］.Journal of Virology，2015，89（11）：6048-6056.

［18］O，Donnell V，Holinka L G，Krug P W，et al.African Swine Fever Virus Georgia 2007 with a Deletion of Virulence-Associated Gene 9GL（B119L），when Administered at Low Doses，Leads to Virus Attenuation in Swine and Induces an Effective Protection against Homologous Challenge［J］.Journal of Virology，2015，89（16）：8556-8566.

［19］曹琛福，梁云浩，陶虹，等.非洲豬瘟病毒P54基因的原核表達及其抗體的間接ELISA檢測方法的建立［J］.動物醫學進展，2014，35（2）：6-10.

［20］靳雯雯，楊俊興，花群俊，等.非洲豬瘟病毒抗體檢測間接ELISA方法的建立［J］.中國獸醫學報，2014，34（7）：1043-1046.

［21］張鑫宇，陳宇，劉文俊，等.非洲豬瘟病毒E183L、B602L、K205R和A104R基因表達及診斷抗原篩選［J］.中國獸醫雜志，2014，50（3）：3-9.

［22］張鑫宇，左偉勇，朱善元，等.非洲豬瘟病毒p54抗體膠體金試紙檢測方法的建立［J］.中國預防獸醫學報，2014，36（4）：281-285.

［23］張彩虹，祝賀，高又文，等.抗非洲豬瘟病毒VP73蛋白雞卵黃抗體的制備及鑒定［J］.中國獸醫科學，2015，45（08）：821-825.

［24］McKillen J，McMenamy M，Hjertner B，et al.Sensitive detection of African swine fever virus using real-time PCR with a 5，conjugated minor groove binder probe［J］.Journal of Virological Methods，2010，168：141-146.

［25］James H E，Ebert K，McGonigle R，et al.Detection of African swine fever virus by loop-mediated isothermal amplification［J］.Virol Methods，2010，164：68-74.

［26］楊吉飛，關貴全，劉志杰，等.一種用于非洲豬瘟病毒檢測的PCR方法［J］.畜牧獸醫學報，2011，42（8）：1201-1206.

［27］崔尚金，胡泉博，劉業兵.非洲豬瘟病毒高效納米PCR檢測方法的建立及初步應用［J］.中國預防獸醫學報，2012，34（10）：807-809.

［28］苗富春.小反芻獸疫病毒、非洲豬瘟病毒、西尼羅病毒、亨德拉病毒及尼帕病毒并聯熒光定量PCR方法建［D］.長春：吉林農業大學，2013.

［29］Grau F R，Schroeder M E，Mulhern E L，et al.Detection of African swine fever，classical swine fever，and foot-and-mouth disease viruses in swine oral fluids by multiplex reverse transcription real-time polymerase chain reaction［J］.J Vet Diagn Invest，2015，27：140-149.

［30］劉建，唐慧林，饒玉燕，等.非洲豬瘟媒介軟蜱在中國潛在的適生性分析［J］.中國媒介生物學及控制雜志，2010，21（4）：317-320.

S852.65+1

A

0529-6005（2016）04-0077-03

2015-06-11

國家高技術研究發展計劃（863計劃）（2012AA101-301）

劉建利（1982-），男，獸醫師，碩士生，從事動物檢疫工作，E-mail：56546521@qq.com

呂建強，E-mail：312899963@qq.com