我國鵝細小病毒研究進展

杜翔宇,李溫明,胡振林,張甜甜,胡桂學,董　浩

(1.吉林農業大學生命科學學院,吉林長春130118;2.鐵嶺出入境檢驗檢疫局,遼寧鐵嶺112616;3.吉林農業大學動物科學技術學院,吉林長春130118)

我國鵝細小病毒研究進展

杜翔宇1,李溫明2,胡振林1,張甜甜1,胡桂學3,董浩1

(1.吉林農業大學生命科學學院,吉林長春130118;2.鐵嶺出入境檢驗檢疫局,遼寧鐵嶺112616;3.吉林農業大學動物科學技術學院,吉林長春130118)

1　小鵝瘟的流行病學

鵝細小病毒(GPV)屬于單股DNA病毒,在分類學上屬于細小病毒科,細小病毒亞科,細小病毒屬的成員.小鵝瘟是由鵝細小病毒引起的一種傳播快、死亡率高、高度接觸性急性或亞急性敗血性傳染病,大多發生在1個月齡以內的雛鵝,2～3日齡的雛鵝即開始發病,7日齡以內的雛鵝最易感染.該病具有較強的傳染性和較高的死亡率,隨著近年來對小鵝瘟病毒流行病學的研究發現,小鵝瘟易感鵝群的發病日齡有逐漸增大的趨勢,而且呈現無規律散發性流行.黃宇翔等采用臨床調查、血清學和病原學檢測技術進行了鵝細小病毒病、鵝副黏病毒病流行病學調查,結果表明,鵝細小病毒流行季節為4～8月份,發病率為60%～70%;鵝副黏病毒病流行季節為5～7月份,發病率10%～20%.二者共同點是對雛鵝有高度的致病性,尤其10日齡以內雛鵝感染后,發病率和死亡率在90%以上,甚至可達100%[1].

2　GPV的分子生物學特征

2.1GPV的基因組特征GPV為DNA病毒,分為正鏈DNA和負鏈DNA,基因組全長約為5.2 kb(分子質量約為6X106Da).GPV基因組的一大特點是正鏈與負鏈DNA分子均含有回文結構的序列,小鵝瘟病毒的兩種DNA鏈在核酸提取很容易出現退火現象,二者結合變成互補的雙鏈DNA.病毒的整個基因組分為編碼區和非編碼區,非編碼區位于編碼區兩側,形成回文序列;編碼區處于中間位置,包含兩個開放閱讀框,分別包括左側LORF和右側RORF,有一個長短為18個堿基的片段將兩者隔開,LORF編碼NS1、NS2非結構蛋白,RORF編碼VP1、VP2、VP3結構蛋白,VP2和VP3蛋白是小鵝瘟的主要保護性抗原,可以誘發機體產生抗體,發生免疫反應.所有的編碼基因彼此重疊,結構基因和非結構基因都有獨立的啟動子區域,具有共同的羧基末端,形成套式的結構. VP基因是GPV的重要基因,關系到病毒毒粒的衣殼蛋白,同時也作為抗原能夠誘導機體產生抗體,同時VP蛋白也關系到病毒的毒力和致病性.

目前僅有7個GPV毒株已知全基因序列,更多GPV毒株的全基因序列測定將有助于理解GPV的遺傳、演化、病毒嗜性、宿主域和致病性等相關信息.王浩等應用PCR方法獲得GPVY株和E株的全基因組核苷酸序列,通過分析VP區糖基化位點的差異發現Y株和E株均缺失703-705 NRT糖基化位點,推測結構蛋白糖基化位點的改變有可能影響病毒的毒力,甚至使病毒形成免疫逃逸[2].張云等采用PCR技術擴增了鵝和番鴨全長細小病毒基因,序列分析表明,鵝和番鴨細小病毒NS之間的核苷酸和氨基酸同源性分別為80.9%～82.9%和89.5%～91.2%,鵝和番鴨細小病毒VP1之間的同源性分別為79.7%～88.7%和85.5%～93.3%[3].王志強等對鵝細小病毒VP1-VP3非重疊區基因的克隆與序列分析,強毒株基因核苷酸序列變化低于弱毒株,這說明目前流行GPV強毒株的基因序列保守性高于弱毒株[4].

2.2結構蛋白GPV能夠編碼3種結構蛋白,分別為VP1、VP2蛋白和VP3蛋白.小鵝瘟病毒的結構蛋白VP的主要功能是刺激機體產生抗體,同時該結構也與病毒的毒力和致病性有密切關系.馬波對鵝細小病毒VP1基因的原核表達及抗原性分析,結果表明,純化的融合蛋白可與GPV陽性血清發生特異性反應,具有良好的抗原性[5].胡曉靜等對2株鵝細小病毒的主要結構蛋白VP2基因的克隆和序列分析,VP2的核苷酸序列全長分別為2 044 bp和2 050 bp,與番鴨細小病毒的同源性為76.8%～80.0%,為細小病毒載體的構建和基因工程疫苗的設計奠定基礎[6].

VP3蛋白在3種核衣殼蛋白中是含量最多,且在GPV或MDPV感染的水禽體內能誘導中和抗體的產生,VP3是檢測GPV或MDPV抗體最合適的候選蛋白.李永峰建立了檢測雛番鴨水禽細小病毒抗體的間接ELISA方法,為水禽細小病毒感染的診斷、免疫后抗體和母源抗體水平檢測以及基因工程疫苗的研究提供了一種簡便、靈敏診斷方法[7].張雅為對實驗免疫的鵝血清抗體進行檢測,結果表明,非結構蛋白NS2的抗體最高峰較結構蛋白VP3的早出現一周,選擇了GPV非結構蛋白NS2作為檢測抗原,為使用重組結構蛋白亞單位疫苗免疫動物時鑒別自然感染與疫苗免疫奠定了基礎[8].

2.3非結構蛋白目前關于GPV非結構蛋白(nonstructural protein,NS)的報道不是很多,遠不如結構蛋白研究的豐富和深入.GPV的非結構蛋白為LORF編碼的NS1和NS2,NS蛋白在GPV復制的早期產生,GPV NS蛋白的主要功能是負責病毒DNA的復制以及對基因表達的調控.NS2蛋白和NS1蛋白共同作用于細胞,產生對細胞有害的毒性,它的主要作用是協同、幫助NS1蛋白對細胞的毒性作用.孫敏華等克隆了鵝細小病毒佛山株的NS1基因,并將其克隆至原核表達載體pET32a(+),構建重組質粒pET32a-NS1,分析表明NS1蛋白得到了表達,并且能與抗GPV的番鴨血清發生特異性反應[9].邢明偉將NS2基因亞克隆于原核表達載體pGEX-6P-1,并將質粒轉化于感受態菌BL21(DE 3)plyS中,經IPTG誘導獲得重組NS2蛋白,發現其可以與GPV陽性血清發生特異性反應[10].

3　細小病毒細胞受體研究進展

病毒感染細胞的第一步就是吸附,病毒能與細胞吸附的關鍵就是要和細胞受體結合.研究病毒的細胞受體可以揭示病毒與宿主細胞之間的關系,了解病毒對各種宿主細胞嗜性,進入細胞的途徑機制以及對宿主敏感細胞的具體影響,還對了解病毒進入細胞后的復制動力學以及其他一些細胞內事件,病毒的增殖與免疫機制相互的關系和作用提供一定參考[11-12].

李凌云等利用酵母雙雜交技術分別構建了"獵物(prey)"蛋白表達載體和麻疹病毒VAP"誘餌(bait)"蛋白表達載體,然后共同轉化進入酵母菌細胞,利用已經建立好的敏感細胞cDNA文庫進行篩選,得到了一個受體蛋白.董浩采用酵母雙雜交技術從鴨胚成纖維細胞的cDNA表達文庫中,篩選出GPV細胞結合蛋白,為闡明小鵝瘟致病、傳播和定植規律的研究奠定基礎,篩選到三個與VP1互作的蛋白,分別為核糖體蛋白S12,翻譯延伸因子EEF1A1以及一種未知蛋白,證實了鴨胚成纖維細胞的核糖體蛋白S12能夠與鵝細小病毒VP1蛋白相結合,為后續尋找能夠與核糖體蛋白互作的其他蛋白奠定基礎.在此研究基礎之上,郭慧通過蛋白體外相互作用的GST Pull-Down技術,驗證S12蛋白與小鵝瘟病毒結構蛋白VP1的相互作用,結合產物經SDS-PAGE凝膠分析,結果證明S12與VP1能夠在體外進行結合,鴨胚成纖維細胞核糖體蛋白S12對GPV的增殖存在一定的抑制作用[13].

4　病毒的檢測方法

臨床上可根據病鵝的臨床癥狀和病理變化作出初步診斷,隨著科學技術的發展,小鵝瘟分子生物學診斷技術取得了很大的進展,由原來傳統的檢測技術受到發展為免疫學技術和高新分子生物學技術的方向快速發展,為當前更有效防制GPV和對GPV進一步研究提供最新的技術保障.朱小麗將抗番鴨GPV單抗腹水采用透析法標記異硫氰酸熒光素,制備成抗GPV熒光抗體,與間接熒光方法的符合率為92.9%,表明GPV熒光抗體具有較好的特異性、敏感性和準確性,可用于臨床快速診斷番鴨小鵝瘟病[14].劉飛成功地制作成了雙抗夾心法GPV膠體金免疫層析試紙條,在10～15 min內可得到檢測結果,敏感度為104.1GELD50/0.2 mL,該試紙條特異性高,重復性好,可用于GPV的臨床快速診斷[15].

荊志強組裝膠體金免疫層析試紙條,并利用Point-of-care testing(POCT)scanner進行定量研究,制得的試紙條與瓊脂擴散試驗、酶聯免疫吸附試驗相比,符合率分別為100%、97.7%,表明膠體金免疫層析技術正是一種簡易、快速的免疫學檢測技術[16].饒桂波建立了PCR-DHPLC檢測方法是一種新的檢測GPV的方法,陽性檢出率達100%,是常規PCR方法的100倍,監測和防制工作上升到新的水平[17].傅秋玲等建立了一種快速檢測鵝細小病毒的LAMP方法,且其檢測靈敏度達150 pg/μL,可見該方法為適合基層及現場快速檢測、實用靈敏的分子生物學方法[18].

5　鵝細小病毒免疫學研究

目前關于鵝細小病毒的免疫學方面的研究熱點主要包括活疫苗、滅活疫苗及基因工程疫苗的研制、單克隆抗體的研制與開發和抗原表位的研究等幾個方面.王倩用篩選出4株分泌抗GPV抗體的陽性雜交瘤細胞株,其中1G3和3B11雜交瘤細胞在體外具有穩定分泌抗GPV單克隆抗體的能力,并對免疫后的抗體水平進行監測,為鵝細小病毒病的疫情監測和免疫抗體效價測定奠定基礎[19].盧菲等鵝細小病毒VP3基因疫苗與弱毒疫苗誘導小鼠免疫應答的比較,結果顯示,小鵝瘟VP3基因疫苗免疫小鼠的外周血T淋巴細胞對ConA刺激的反應,誘導的CD4+、CD8+T淋巴細胞免疫功能和血清IgG抗體水平在不同時間段都顯著或極顯著高于弱毒疫苗免疫組[20].郭鷺利用Ni-NTA親和層析純化后的GPV VP3重組蛋白作為免疫原,通過Western Blot定位出兩個抗原表位為430～435 aa和643～647 aa[21].王娟對抗GPV單克隆抗體的抗原表位分析,結果顯示,在VP3基因的135～332 aa和322～535 aa處用間接免疫熒光檢測,并初步確定3E8株單抗的抗原表位在322～332 aa上[22].

6　展望

蛋白質相互作用的研究,是揭示生物體正常生長發育及其應對各種生物或非生物脅迫的分子機制重要途徑,深入研究小鵝瘟病毒的復制機理、揭示病毒結構蛋白與宿主細胞蛋白的相互作用,從蛋白質水平闡明病毒侵染的過程,將會成為我們未來研究工作的重點;同時為了加強該病的流行監測,進一步完善和建立及時、準確、快速的檢測方法,是該病臨床診斷、防疫與檢疫的迫切要求,將有助于降低該病在家禽的流行;鵝細小病毒免疫學是研究鵝細小病毒工作的重要組成部分,研制基因工程活載體疫苗和DNA疫苗等新型疫苗也勢在必行;我國小鵝瘟研究工作雖然取得了一定的成果,但是目前的小鵝瘟防控仍舊存在問題,一些科學研究成果還沒得到應用和推廣,需要研究工作者在小鵝瘟病毒方面的研究付出更多的努力.

[1]黃宇翔,劉力威,李洪彬,等.鵝細小病毒病、副黏病毒病的流行病學調查及病原分離鑒定[J].中國家禽,2013,35(2): 22-29.

[2]王浩,田先舉,張爍,等.2株鵝細小病毒全基因組特征分析[J].畜牧獸醫學報,2013,44(40):602-609.

[3]張云.鵝和番鴨細小病毒全基因克隆與序列分析[J].中國預防獸醫報,2008,30(6):415-419.

[4]王志強.鵝細小病毒VP1_VP3非重疊區基因的克隆與序列分析[J].中國家禽,2011,33(19):28-30.

[5]馬波.鵝細小病毒VP1基因的克隆序列分析及表達載體的構建[J].中國獸醫科學,2010,40(2):135-138.

[6]胡曉靜.2株鵝細小病毒的主要結構蛋白VP2基因的克隆和序列分析[J].現代農業科技,2008,23:261-264.

[7]李永峰.鵝和番鴨細小病毒VP3-ELISA診斷方法的建立[D].北京:中國農業科學院,2010.

[8]張雅為.鵝細小病毒VP3-ELISA和NS2-ELISA檢測方法的建立及抗體消長規律的測定[D].哈爾濱:東北農業大學,2008.

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[10]邢明偉.鵝細小病毒NS2基因的原核表達及抗原性檢測[J].中國預防獸醫學報,2010,32(2):148-150.

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[13]郭慧.GPV VP1蛋白與DEF核糖體蛋白S12的互作驗證及其對GPV增殖的影響[D].長春:吉林農業大學,2014.

[14]朱小麗.應用膠乳凝集技術診斷番鴨小鵝瘟病[J].中國預防獸醫學報,2012,34(9):715-718.

[15]劉飛.抗小鵝瘟病毒單克隆抗體的制備及膠體金免疫層析試紙條的研制[D].南京:南京農業大學,2011.

[16]荊志強.鵝細小病毒抗體膠體金免疫層析檢測試紙條的研制[D].哈爾濱:東北農業大學,2010.

[17]饒桂波.鵝細小病毒的分離鑒定及PCR-DHPLC檢測方法的建立與初步應用[D].長春:吉林農業大學,2013,28-37.

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[19]王倩.鵝細小病毒NS基因PCR和單抗競爭ELISA檢測方法的建立及應用[D].哈爾濱:東北農業大學,2011.

[20]盧菲.鵝細小病毒VP3基因疫苗與弱毒疫苗誘導小鼠免疫應答的比較[J].中國獸醫科學2008,38(07):576-581.

[21]郭鷺.抗鵝細小病毒VP3蛋白單克隆抗體的制備及對應抗原表位的定位[J].中國動物傳染病學報,2013,21(4):1-6.

[22]王娟.鵝細小病毒VP3基因的原核表達及其單克隆抗體的研制[D].揚州:揚州大學,2012.

S852.65+9.2

A

0529-6005(2016)06-0063-03

2015-05-25

吉林省科技發展計劃項目(20130522086JH);高等學校博士學科點專項科研基金(20112223110002);吉林省現代農業產業技術體系建設專項資金(201231);吉林省教育廳科學技術研究項目(2015209)

杜翔宇(1989-),女,碩士生,從事分子病原微生物與分子免疫學研究,E-mail:dxy1209@163.com

董浩,E-mail:donghao_jlau@163.com