基于液相色譜-串聯質譜聯用技術的臨床代謝組學中樣本前處理方法的研究進展Δ

王　瑋，王曉雪，李朋梅，張相林

(衛生部中日友好醫院藥學部，北京　100029)

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基于液相色譜-串聯質譜聯用技術的臨床代謝組學中樣本前處理方法的研究進展Δ

王瑋*，王曉雪，李朋梅，張相林#

(衛生部中日友好醫院藥學部，北京100029)

代謝組學是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學后的新興“組學”研究方法，是系統生物學的重要組成部分[1]。作為一門研究生物體內源性代謝物整體及其變化規律的科學，代謝組學以組群指標分析為基礎，以高通量檢測和數據處理為手段，以信息建模與系統整合為目標，對某一生物或細胞在特定生理時期內所有低分子量(<1 000 Da)代謝物同時進行定性和定量分析，具有較好的預見性和可靠性，可準確、有效地判定不良反應程度，是尋找新型可靠生物標記物的重要手段，在疾病的早期發現、機制研究以及藥物安全性評價等方面發揮著重要作用[2-5]。臨床代謝組學研究的樣本包括生物液體和組織，由于尿液和血液收集簡單、易于長期檢測及包含大量的代謝信息，已成為代謝組學研究的常用標本。對樣本進行適當的前處理，使檢測的準確度、精密度、重現性等符合要求，是研究的基礎。代謝組學的研究對象是生理、病理過程中的代謝產物，盡可能多地減少代謝產物的損失、獲得更多的代謝產物是前處理的目標，同時，需兼顧方法重現性好、前處理步驟少、節約處理時間、盡量減少引起變異因素等。根據研究對象、研究目的等的不同，前處理具體步驟也不同。因此，做好生物樣本的前處理是臨床代謝組學研究的重要前提。初期，代謝組學研究主要采用核磁共振波譜法(nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)、質譜法(mass spectrometry，MS)為核心的分析技術。近年來，不同類型串聯質譜儀不斷發展，其不僅可以實現高通量分析，還可同時獲得分子離子和子離子的精確質量數，有利于獲取分子式及代謝物的裂解特征信息、有效進行未知化合物的解析，因此非常適合尋找及鑒定標志物。由于其獨特的研究角度和技術優勢，MS已超過NMR成為應用最廣泛的代謝組學工具，并迅速應用于醫學、藥學及生物學的各個研究領域，取得了巨大的成就[6-9]。本文對基于液相色譜-串聯質譜聯用法(liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)的臨床代謝組學研究中生物樣本前處理方法進行綜述。

1　尿液前處理方法

尿液中主要含有極性的低分子量代謝物，包括羧酸類、有機胺類、氨基酸類等，同時含有少量細胞、微量大分子物質以及磷酸鹽、硫酸鹽等各種鹽類。尿液的前處理方法較其他體液相對簡單，但其所含物質的極性、pH、滲透壓等有較大差異，尤其機體處于壓力狀態時尿液中多種成分的差異性更大，這對尿液的前處理又帶來一定的難度[2]。目前，尿液的前處理多采用離心后稀釋的方法。首先將尿液離心后，用純水或有機試劑以1 ∶1～1 ∶3的體積比進行稀釋，隨后轉移至進樣瓶或96孔板中，處理好的樣本于0～4 ℃條件下儲存待測。Guy等[10]的研究中，將收集到的尿液標本分裝在1.5 ml EP管中，在-80 ℃下儲存備用。檢測前將樣本在室溫(25 ℃)下融化，精密量取25 μl，加入75 μl蒸餾水(高效液相色譜/MS級)稀釋，稀釋后的樣本裝入進樣瓶，待測。Li等[11]曾報道，將800 μl乙腈加入800 μl尿液標本中，渦旋1 min混勻，13 000 r/min轉速下離心10 min，取1 400 μl上清液揮干，用70%的乙腈200 μl復溶，渦旋1 min，4 ℃、13 000 r/min轉速下離心10 min，取上清液進樣等。這種將尿液稀釋后進樣的前處理方法，可減少尿液基質對LC-MS/MS分析測定的影響，最大限度減少分析物的丟失[12-13]，且簡便易行。但是，稀釋可能造成信號強度降低，使部分含量較低的代謝物可能無法被檢測[14]。另外，也可通過分子過濾器除去尿液中微粒及少量蛋白質的方法進行前處理，如將1 ml尿液標本在4 000 r/min轉速下離心10 min，取300 μl上清液，加入600 μl甲醇，渦旋10 min混勻，然后在4 ℃、14 000 r/min轉速下離心10 min，取800 μl上清液經0.45 μm過濾器濾過后，低溫保存待測[15]。這種處理方法可有效降低污染的風險，但處理成本稍高。此外，還有文獻報道可將尿液冷凍干燥后用甲醇等有機溶劑進行提取[16]，該方法重現性較好，但可能會造成尿液中揮發性成分的丟失，改變尿液的特征代謝指紋譜[17]。

2　血液前處理方法

血液是代謝組學研究中重要的體液樣本，其成分較尿液更為復雜。血液樣本類型包括血清、血漿和全血。血清和血漿中所含成分種類繁多，極性跨度很大，同時含有大量的蛋白質。因此，應用LC-MS/MS進行分析前需去除蛋白，前處理方法需兼顧不同極性代謝物的性質，可實現多種代謝物的高通量監測。

2.1非靶向代謝組學

目前，非靶向代謝組學研究中血液樣本前處理常用方法為有機溶劑沉淀法，多采用甲醇或乙腈作為蛋白沉淀劑處理血樣。如Zhu等[18]曾報道，在50 μl血清中加入150 μl甲醇，渦旋2 min，-20 ℃下靜置20 min，然后將樣本在14 000 r/min轉速下離心10 min，將上清液轉移到新的EP管中；加入300 μl甲醇于下層沉淀，渦旋10 min，14 000 r/min轉速下離心10 min；取上清液，與上次萃取的上清合并，將合并的萃取液揮干后，用500 μl乙腈-水(V∶V=60 ∶40，5 mmol/L醋酸銨，0.2%乙酸)復溶后進樣。該方法對樣本進行2次萃取，代謝物提取比較完全，但步驟較為繁瑣，如果進行大批量樣本前處理，則樣品的均一性難以得到有效保證。目前，通用前處理方法是有機溶劑沉淀蛋白1次。通常向待測的血漿或血清樣本中加入3倍體積的冰凍甲醇或乙腈，渦旋，12 000 r/min轉速下離心10 min除去沉淀的蛋白；將離心后的上清液轉移至新的EP管中，揮干后用水-乙腈混合溶液(V∶V=95 ∶5)復溶；渦旋，12 000 r/min轉速下離心5 min，將上清液轉移至進樣瓶或96孔板等，將進樣瓶等放入0～4 ℃自動進樣器中進樣分析[19-20]。另外，也有研究對樣本沉淀蛋白后直接進樣。具體處理為：100 μl血清樣本中加入300 μl冰甲醇，渦旋30 s；4 ℃、14 000 r/min轉速下離心10 min，取上清液進樣分析[21]。該方法減少了濃縮步驟，操作較通用的方法更簡單，但由于對樣品進行了稀釋，導致低含量代謝物有可能檢測不到，所以對儀器靈敏度要求較高。以往文獻中多采用甲醇或乙腈與待測血樣3∶1的體積比進行蛋白沉淀，且采用冰凍的有機試劑或加入有機試劑后在-20 ℃下孵育一定時間進行前處理，可優化前處理方法。同時，也有文獻采用有機試劑與血樣4 ∶1的體積比進行前處理，如Luo等[22]曾報道，將100 μl血清中加入400 μl乙腈(含內標)，渦旋60 s，4 ℃、14 000 r/min轉速下離心10 min，取200 μl上清液轉移至EP管中揮干，用50 μl乙腈-水溶液(V∶V=1 ∶4)復溶，取上清液進樣分析。此外，也有文獻報道使用異丙醇作為沉淀劑，如50 μl血漿中加入150 μl冰凍異丙醇，室溫(25 ℃)下孵育10 min，-20 ℃下過夜，然后在4 ℃、14 000 r/min轉速下離心20 min，取100 μl上清液進樣[23]。常用于化合物純化、去除蛋白的固相萃取法，似乎并不太適合代謝組學的樣本前處理。有研究通過考察不同有機溶劑沉淀蛋白和固相萃取技術對血漿中蛋白質的去除程度以及對待測物的提取效果，發現前者的提取效率和沉淀蛋白效果較好[24]。

2.2靶向脂質組學

在靶向脂質組學研究中，脂質類成分提取的“金標準”方法是采用三氯甲烷(CHCl3)-甲醇(V∶V=2∶1)混合溶劑進行提取[25]，也有報道采用二氯甲烷(CH2Cl2)-甲醇提取法[26]或甲基叔丁基醚(MTBE)-甲醇提取法[27]。習聰等[28]比較了CHCl3-甲醇(V∶V=2 ∶1)、CH2Cl2-甲醇(V∶V=2 ∶1)、MTBE-甲醇(V∶V=4 ∶1)3種混合溶劑作為提取溶劑時血清樣本脂質類成分的提取效果，結果顯示，CH2Cl2-甲醇的提取效果最佳，且CH2Cl2的毒性遠小于CHCl3，采用CH2Cl2-甲醇作為提取劑的安全性較高。具體處理步驟如下：血清樣本于4 ℃下解凍，取血清30 μl加入CH2Cl2-甲醇(V∶V=2 ∶1)(含0.1 g/L 2,6-二叔丁基-4-甲基酚，0 ℃)混合溶劑600 μl中，渦旋并靜置，加入水200 μl，離心后取有機相氮氣吹干，加入乙腈-異丙醇(V∶V=1 ∶1)混合溶劑500 μl，復溶，10 000 r/min轉速下離心10 min后，取上清液進樣。

3　組織前處理方法

不同組織器官的前處理方法各有不同。肝臟組織前處理可采用以下方法：取5 g左右肝臟組織，加入300 μl冰甲醇-水(V∶V=4 ∶1)混合溶液，混勻后放入組織勻漿儀中，將樣本在冰上靜置20 min，4 ℃下渦旋(轉速為14 000 r/m)10 min，對上清液進樣分析[21]。骨組織前處理可將冷凍在液氮中的骨組織取出，稱取50 mg，用組織研磨機研磨，然后依次加入400 μl乙酸乙酯-乙醇混合液(V∶V=1 ∶1)、200 μl無水甲醇、200 μl無水甲醇-水(V∶V=3 ∶1)混合液、200 μl CH2Cl2-甲醇(V∶V=3 ∶1)混合液，其中每加入1種溶液后在研磨機中振搖2 min，12 000 r/min轉速下離心5 min，取上清液，然后將多次萃取的上清液混勻，用氮氣吹干，用100 μl甲醇-超純水(V∶V=4 ∶1)混合液復溶，渦旋2 min，超聲10 min，12 000 r/min轉速下離心10 min后，取上清液進樣[29]。

總之，臨床生物樣本所含化合物種類繁多、極性跨度大，既有高極性的氨基酸、核苷酸類、葡萄糖等，也有低極性的脂類、膽固醇類等成分。在分析前不僅需要除去基質以減少對色譜柱和質譜儀的干擾、污染，同時還要保證代謝物的全面、無差別、高通量的提取。如同一種分析檢測平臺不能夠完全滿足代謝組檢測的要求，對生物樣本的前處理單靠一種方法也往往難以實現全覆蓋、快速分析的要求，在尋找代謝標志物的研究中更是如此。目前，臨床代謝組學的樣本前處理研究缺乏統一的標準操作規程。本文也僅是對通用前處理方法進行了總結。但是，相信隨著前處理技術的不斷創新，前處理條件的不斷優化以及標準操作規范的逐步建立，生物樣本的前處理會更簡便、全面、高效。

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2016-06-17)

國家自然科學青年基金(No.81503175)；北京市自然科學青年基金(No.7154237)；中日友好醫院青年基金(No.2014-3-QN-27)

主任藥師，副教授，碩士生導師。研究方向：個體化給藥與臨床藥理學。E-mail：zryhyyzxl@126.com

R969.1

A

1672-2124(2016)07-0868-03

10.14009/j.issn.1672-2124.2016.07.002

*藥師，碩士。研究方向：臨床藥學。E-mail：67671218@qq.com