疫苗研究　豬偽狂犬病毒變異毒株的特性及其疫苗的研究現(xiàn)狀

李國新，童 武，鄭 浩，童光志（中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

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疫苗研究豬偽狂犬病毒變異毒株的特性及其疫苗的研究現(xiàn)狀

李國新，童 武，鄭 浩，童光志*
（中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

豬偽狂犬病是由偽狂犬病毒引起的高死亡率的急性傳染病。該病在我國發(fā)生較為嚴重，是嚴重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的疫病之一。我國于20世紀70 年代從匈牙利引進了偽狂犬疫苗Bartha-k61株，自20世紀90 年代以來國內規(guī)模化豬場普遍使用該基因缺失疫苗，使豬偽狂犬病得到了很好的控制。但是，自2011年以來，一種由偽狂犬病毒變異毒株引起的豬偽狂犬病在我國暴發(fā)，造成母豬繁殖障礙和初生乳豬死亡，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失[1-4]。針對新出現(xiàn)的偽狂犬病毒變異毒株，國內多家研究機構對其基因特征、抗原性和致病性等進行了一系列的研究，并在此基礎上，開展了疫苗的研制工作。

1 偽狂犬病毒變異毒株的基因特征

通過對偽狂犬病毒的全基因組以及各基因序列進行比較分析，發(fā)現(xiàn)我國分離的偽狂犬病毒基因序列與國外（主要是歐洲及美洲）分離的毒株序列存在顯著的差異，系統(tǒng)發(fā)育分析進一步表明中國的分離株與國外的分離株進化關系較遠，形成兩個不同的基因型。病毒毒力相關基因比較分析顯示，我國新出現(xiàn)的變異毒株與國內早期經典毒株Ea株和Fa株存在一定的遺傳差異，不過這些差異對病毒毒力和感染特性的影響還需要進一步研究[5]。

2 偽狂犬病毒變異毒株致病性分析

與經典的偽狂犬病毒強毒株相比，偽狂犬病毒變異毒株對小鼠和豬的致病力明顯增強。我們的研究進一步證實，對于15日齡、30日齡和60日齡的豬，偽狂犬病毒變異毒株感染豬發(fā)病更快，臨床癥狀和病理變化更嚴重，死亡率也更高。而且，感染豬的臨床表現(xiàn)與豬的日齡、毒株的毒力以及接種劑量密切相關[6]。

3 偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）和變異毒株的抗原性差異

Bartha-k61株誘導的中和抗體對變異毒株的中和能力遠低于對Bartha-k61 株或經典強毒株的中和能力。而變異毒株誘導的中和抗體對變異毒株和Bartha-k61株都具有較高的中和能力。表明偽狂犬病毒變異毒株與傳統(tǒng)疫苗株及經典強毒株的抗原性存在一定的差異。對于偽狂犬病毒變異毒株的攻擊，豬偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）對接種羊只能提供50%的保護；而對于經典偽狂犬病毒強毒株的攻擊，則提供了100%的保護。同樣，對于偽狂犬病毒變異毒株的攻擊，Bartha-K61株對接種豬只能提供部分保護[7]。偽狂犬病毒變異毒株增強的毒力與抗原性變化可能是導致疫苗免疫豬場發(fā)生豬偽狂犬病的重要原因。

4 豬偽狂犬病疫苗研制現(xiàn)狀

對于新出現(xiàn)的偽狂犬病毒變異毒株的侵襲，傳統(tǒng)的偽狂犬病疫苗已不能提供完全的保護。感染豬場偽狂犬病毒gE 抗體陽性率顯著升高，并伴有母豬繁殖障礙和初生乳豬死亡。因此，針對偽狂犬病毒變異毒株，國內多家研究機構開展了疫苗的研制工作。

4.1 豬偽狂犬病基因缺失活疫苗的研制

4.1.1 豬偽狂犬病雙基因缺失疫苗候選毒株 中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所利用同源重組技術把偽狂犬病毒變異毒株（JS-2012株）進行基因缺失，構建了gE和gI雙基因缺失的偽狂犬病毒（JS-2012-△gI/gE株）。該毒株接種11日齡仔豬不引起任何臨床癥狀，而且該毒株不能水平傳播和垂直傳播，安全性良好。用105.0TCID50的JS-2012-△gI/gE株肌肉注射或鼻腔接種4周齡仔豬，能誘導高水平的中和抗體，并能使接種豬完全抵抗偽狂犬病毒變異毒株（JS-2012株）的攻擊。中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所利用同源重組技術把偽狂犬病毒變異毒株（TJ株）進行基因缺失，構建了gE和gI雙基因缺失的偽狂犬病毒（rPRVTJ-delgE株）。該毒株在PK-15細胞上的增殖滴度低于其母源毒株（TJ株），但與疫苗株（Bartha-K61株）無明顯差別。用103、104和105TCID50的rPRVTJ-delgE分別接種6周齡仔豬，7天內沒有觀察到臨床反應，也沒有檢測到病毒排出。接種后第7天用偽狂犬病毒變異毒株（TJ株）攻擊，所有的接種豬都得到了保護。在攻毒前，即使沒有檢測到中和抗體的仔豬，也能抵抗強毒的攻擊[7]。這提示，偽狂犬病毒雙基因缺失毒株可以快速激發(fā)機體免疫應答，使接種豬能抵抗強毒的攻擊，而這種保護與中和抗體水平并無必然的聯(lián)系。

4.1.2 豬偽狂犬病三基因缺失疫苗候選毒株 中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所在雙基因缺失毒株（rPRVTJ-delgE株）的基礎上，進一步缺失了TK基因，構建了三基因缺失的偽狂犬病毒（ rPRVTJ-delgE/ gI/TK 株）。實驗證明，該毒株安全性與免疫原性良好[8]。國家獸用藥品工程技術研究中心利用細菌人工染色體技術（BAC）把偽狂犬病毒變異毒株（HN1201株）進行了基因缺失，構建了TK、gE和gI三基因缺失的偽狂犬病毒（vPRV HN1201TK-/gE-/gI-株）。與母源毒株（HN1201株）相比，三基因缺失毒株（vPRV HN1201TK-/gE-/ gI-株）在Vero細胞上有相似的生長特性，基因缺失對病毒在Vero細胞上的增殖沒有產生大的影響。用107TCID50的vPRV HN1201 TK-/gE-/gI-鼻腔接種9日齡仔豬，沒有觀察到臨床反應。4周后，用107TCID50的偽狂犬病毒變異毒株（HN1201株）攻擊，對照組豬全部死亡，而免疫組豬除了個別豬有一過性的發(fā)熱外，沒有表現(xiàn)出其他任何臨床癥狀[9]。華中農業(yè)大學利用同源重組技術把偽狂犬病毒變異毒株（SMX株）進行基因缺失，構建了TK、gE和gI三基因缺失的偽狂犬病毒（rSMX△gI/ gE△TK株）。該毒株接種1日齡仔豬不引起任何臨床癥狀，哨兵豬也一直保持偽狂犬病毒抗體陰性。用106.0TCID50的rSMX△gI/gE△TK肌肉注射接種3周齡仔豬，能誘導高水平的中和抗體，并能使接種豬完全抵抗偽狂犬病毒變異毒株（SMX株）的攻擊[10]。

4.2 豬偽狂犬病基因缺失滅活疫苗的研制

4.2.1 豬偽狂犬病單基因缺失滅活疫苗候選毒株 國家獸用藥品工程技術研究中心利用同源重組技術把偽狂犬病毒變異毒株（HN1201株）進行了基因缺失，構建了gE基因缺失的偽狂犬病毒（HN1201△gE株）。該毒株在PK-15上的生長特性與母源毒株（HN1201株）沒有明顯差別。利用該毒株制備的滅活疫苗免疫3周齡仔豬，免疫后1周檢測到了中和抗體。4周后，用107TCID50的偽狂犬病毒變異毒株（HN1201株）攻擊，對照組豬全部發(fā)病并死亡，而免疫組豬只是在攻毒后4天內有一過性的發(fā)熱，沒有表現(xiàn)出其他任何明顯的臨床癥狀[11]。

4.2.2 豬偽狂犬病雙基因缺失滅活疫苗候選毒株 中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所利用構建的gE 和gI雙基因缺失毒株（JS-2012-△gI/gE株）進行了豬偽狂犬病滅活疫苗的研制。該滅活疫苗高劑量接種2周齡仔豬，不引起任何臨床不良反應，不影響仔豬的生長。用該滅活疫苗高劑量接種妊娠約45日左右的母豬，不引起任何臨床不良反應，也不影響母豬的生產性能。該滅活疫苗免疫仔豬能產生高水平的中和抗體，并能抵抗偽狂犬病毒變異毒株（JS-2012株）的攻擊。該滅活疫苗免疫妊娠母豬，可以使初生仔豬獲得被動免疫保護。南京農業(yè)大學利用細菌人工染色體技術（BAC）把偽狂犬病毒變異毒株（ZJ01株）進行了基因缺失，構建了gE和gI基因缺失的偽狂犬病毒（vZJ01△gE/gI株）。把偽狂犬病毒（vZJ01△gE/gI株）滅活后制備成滅活疫苗，免疫4周齡仔豬，能夠誘導產生針對變異株的中和抗體。第二次免疫后3周用106TCID50的偽狂犬病毒變異毒株（ZJ01株）攻擊，對照組豬全部死亡，而免疫組全部保持健康[12]。

總之，對于新出現(xiàn)的偽狂犬病毒變異毒株，國內的研究機構做了大量的工作。對偽狂犬變異毒株的基因特征、抗原性以及毒力等生物學特性有了初步的認識，這對疫苗的研制提供了良好的基礎。無論是活疫苗還是滅活疫苗，豬偽狂犬病疫苗的研究策略都以基因缺失毒株作為疫苗候選毒株，這樣既降低了疫苗候選毒株的毒力，還有利于利用血清學方法對疫苗接種豬和野毒感染豬進行鑒別診斷。目前，針對新出現(xiàn)的偽狂犬病毒變異毒株，國內的研究機構正在加緊研制豬偽狂犬病基因缺失活疫苗或滅活疫苗，并進展順利。在不久的將來，一批優(yōu)良的疫苗就會從實驗室走向市場，為偽狂犬病的控制甚至根除做出貢獻。

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收稿日期：（2016-01-07）

*通訊作者，gztong@shvri.ac.cn

基金項目：上海市青年自然科學基金（14ZR1448900)和上海市農委科技興農項目資助（滬農科攻字（2015）第1-7號）