胚胎干細胞試驗預測胚胎毒性替代方法進展

程樹軍，秦　瑤，喻　歡，陳　彧,

(1.廣東出入境檢驗檢疫技術中心，廣州　510623; 2. 廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室，廣州　510623;3. 廣州市華代生物科技有限公司，廣州　510623; 4.中山大學公共衛生學院,廣州　510080)

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胚胎干細胞試驗預測胚胎毒性替代方法進展

程樹軍1,2，秦瑤3，喻歡4，陳彧1,3

(1.廣東出入境檢驗檢疫技術中心，廣州510623; 2. 廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室，廣州510623;3. 廣州市華代生物科技有限公司，廣州510623; 4.中山大學公共衛生學院,廣州510080)

【摘要】小鼠胚胎干細胞試驗(EST)是通過ECVAM正式驗證的胚胎和發育毒性的動物試驗替代方法。在新技術的推動下，多項優化的EST方法通過基因轉染、利用人來源的干細胞、增加檢測通量、組合檢測終點、量化檢測指標等方式，提高了EST方法預測胚胎毒性的科學相關性和檢測效率。在整合測試策略的原則之下，經過大規模化學物質的前驗證和標準化試驗，新的EST方法可單獨或作為組合試驗的一部分可以應用于先導藥物的研發和化學品的胚胎毒性預測及機制研究。

【關鍵詞】胚胎干細胞試驗；胚胎和發育毒性；替代方法；預測

胚胎干細胞是毒性預測的有用工具，2003年，歐洲替代方法驗證中心(european centre for validation of alternative methods, ECVAM)發布了通過驗證的胚胎干細胞試驗方法(embryonic stem cell test，EST)，成為胚胎和發育毒性動物試驗的三個替代方法之一[1]。經典的EST方法周期偏長、通量低，形態觀察的檢測終點量化程度低。10多年來，傳統的EST方法已取得了重要進展，例如誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPS)技術的革命性突破，解決了測試系統來源困難的問題[2]；基于微孔培養技術與流式標志物分析的高通量測試提高了定量檢測毒性終點的效率[3-4]；“組”學技術和信號轉導技術的運用優化了檢測終點的特異性[5-6]。技術上的進步提高了EST方法的適用范圍，為胚胎干細胞應用于毒性機制研究和預測研究提供了快速發展的機遇，同時也對這些優化方法的驗證提出了挑戰。

1驗證的EST方法

德國動物試驗替代方法評價中心(Centre for Documentation and Evaluation of Alternative Methods to Animal Experiments, ZEBET)于1997年建立了利用兩種小鼠細胞系(成纖維細胞3T3和胚胎干細胞D3)進行胚胎毒性測試的替代方法，2003年，經過優化的EST方法通過了ECVAM的驗證[1]。2009年，采用E14Tg2A小鼠胚胎干細胞系的EST 方法發布成為SN標準[7]。EST方法采用了兩種細胞，其中mES(胚胎干細胞)代表胚胎組織，3T3成纖維細胞代表成體組織。試驗由三個程序組成，分別是檢測受試物的mES細胞毒性、3T3細胞毒性和檢測抑制胚胎干細胞分化為心肌細胞的能力。ES細胞分化抑制實驗為EST方法的關鍵，實驗時mES細胞先進行懸滴培養，3 d后將形成的胚胎體(embryoid bodies，EB)轉移至含有不同濃度化學物培養基的培養皿中懸浮培養。培養2 d后再將其接種在含相應化學物濃度的24孔組織培養板內進行貼壁培養。培養5 d后在相差顯微鏡下進行觀察，計數含搏動心肌細胞的孔數，與對照組相比，得出不同濃度化學物抑制ES細胞向心肌細胞分化的百分比。根據濃度-反應曲線計算ES細胞分化抑制50%的化學物濃度(ID50)。

實驗得到3個毒理學反應終點的參數，分別是① ES細胞半數分化抑制濃度(ID50)；② 3T3細胞半數生長抑制濃度(IC503T3)；③ ES細胞半數生長抑制濃度(IC50ES)。ECVAM驗證的預測模型把試驗結果轉化為線性判別函數，通過公式分別計算判別值Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。Ⅰ=5.916 Ig(IC503T3) + 3.500 Ig (IC50ES) - 5.307 [(IC503T3-ID50) / IC503T3] -15.27，Ⅱ=3.651 Ig (IC503T3) + 2.394 Ig (IC50ES) - 2.033 [(IC503T3-ID50) / IC503T3] - 6.85，Ⅲ=-0.125 Ig (IC503T3) - 1.917 Ig (IC50ES) +1.500 [(IC503T3-ID50) / IC503T3] - 2.67。最后根據判別值預測胚胎毒性并分類。無胚胎毒性：Ⅰ>Ⅱ且Ⅰ>Ⅲ；弱胚胎毒性：Ⅱ>Ⅰ且Ⅱ >Ⅲ；強胚胎毒性：Ⅲ>Ⅰ且Ⅲ>Ⅱ。驗證研究表明EST試驗的總預測準確度可達78%。

EST方法是快速篩查環境污染物胚胎毒性的可靠方法，如用于環境雌激素、三唑類殺菌劑、酚、酞酸酯、農藥等的評估。也可以用于工程納米材料胚胎毒性的研究，如研究表明用金或硅烷包被的鈷鐵氧體納米顆粒分類為非胚胎毒性，而其它納米顆粒如金鹽、鈷鐵氧鹽等分類為弱胚胎毒性。EST試驗很少發現假陰性結果，但值得注意的是有些特異性抑制其它組織發育，如腭區、四肢或神經系統發育的致畸物，可能在標準EST中檢測不出。

2試驗系統的優化

2.1人ES源多能干細胞

有研究采用兩種人的胚胎干細胞系H9和LSJ-1，誘導分化3 d后形成單層多能干細胞，受試物作用后檢測內胚層細胞轉錄因子SOX17核轉錄的減少情況。對已知體內效應的71種藥物相關化合物的致畸作用研究表明，當閾值設為5 μm時，精確性為94%(97%敏感性和92%特異性)。進一步研究15種理化特性不同于小分子藥物的環境毒物，發現與體內致畸作用高度一致[3]。胚胎毒性預測的體外方法最好選擇人來源的細胞，這也是“基于胚胎干細胞的新的替代試驗”歐洲研究聯盟(Embryonic Stem cell-based Novel Alternative Testing Strategies，ESNATS)達成的共識，在聯盟合作框架下，已開發了多個基于人胚胎干細胞(hESC)的方法，覆蓋發育過程的不同方面。如NKK系統模擬早期多胚層的分化，UKNI系統模擬特定的神經內胚層的分化，UKN2系統，也稱為“神經嵴遷移抑制試驗(migration of neural crest cell， MINC)，用于評估對神經分化有影響的胚胎毒性。可見把胚胎發育不同階段進行細分類，在ES細胞定向分化過程中給予毒性干預是建立特異性EST替代方法的有效途徑。

1.2誘導多能干細胞

人誘導多能干細胞(iPS)具有與人ES細胞相同的分化能力，在毒理學領域應用前景廣泛，而且不涉及生物學倫理問題。例如反應停的毒性測試，已證明利用嚙齒類動物的體內實驗結果與人存在極大的差異性，同樣mEST 方法的預測分類為弱胚胎毒性。因為反應停的作用機制在于抑制對四肢發育的調節起關鍵作用的泛素連接酶的活性，采用檢測心肌分化為終點的傳統EST方法顯示其特異性不足。如果采用來源于人骨髓單核細胞的iPS檢測反應停的胚胎毒性則結果為強胚胎毒性。類似的情況也出現在抗癲癇藥丙戊酸鈉的檢測中，因此來源于人的iPS建立的試驗系統比mEST 方法預測性更好[2]

1.3轉染熒光素酶

EST試驗周期長達10 d，如果把心肌分化的檢測指標提前可以縮短實驗時間。早期嘗試將綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因轉入ES細胞，通過檢測GFP熒光直觀判斷反應終點，GFP的表達在第7天達到高峰[4]。Suzuki等[8]用心臟和神經冠衍生物表達轉錄蛋白1(Hand 1)或心肌病相關蛋白1(Cmya 1)基因穩定轉染的ESC細胞為測試系統，建立了96孔板檢測熒光素酶報告基因的方法，稱為“Hand 1-Cmya 1-ESTs”。Hand 1和Cmya 1在心臟的早期發育過程中起到關鍵作用，可以代替心肌跳動作為毒性效應的終點，檢測時間可縮短到6 d。由于只轉染Hand 1基因的細胞較轉染兩個基因的細胞熒光素酶的信號強，最新優化的方案稱為“Hand 1-Luc ESTs”方法，進一步縮短檢測時間至5 d[9]。

3檢測終點及組合

3.1場電位

傳統EST方法以顯微鏡觀察跳動的心肌細胞為檢測終點，通量低，以心肌場電位作為終點可以實現高通量。采用含有多電極陣列的培養室培養小鼠D3胚胎干細胞，檢測胚胎毒性物質作用引起的分化細胞的場電位、心肌跳動和抗心肌鈣蛋白的免疫組化，結果三者具有一致性[6]。

3.2神經胚胎干細胞試驗

心肌分化主要與中胚層相關，因而經典EST方法不能檢測可能對其它胚層發育產生影響的毒物。隨著EST細胞向不同胚層細胞分化技術的日漸成熟，目前已開發出促進ES細胞向神經外胚層優勢分化的培養基和方法，ES細胞分化培養13 d，可基于形態學分析(如樹突生長評價)和轉錄組學分析(以致癌基因的生物學發生過程為主)，篩查和預測神經發育胚胎毒性的化合物[10]。這類方法稱為神經胚胎干細胞試驗(nEST)。如用于卡馬西平、鄰苯二甲酸單乙基己基酯、氟硅唑苯妥英、環唑醇、己唑醇、丙戊酸等藥物的篩查。單個化合物體外檢測中組合EST和nEST的終點，可明顯提高檢測的效率和準確性。

3.3非心肌細胞分化

以心肌細胞分化為終點的EST方法的總準確度可達78%，如果同時檢測化合物對ES細胞向心肌分化、成骨分化、軟骨分化和神經分化的抑制作用可提高其預測準確性和特異性。成骨細胞來源于中胚層，對于骨基質產生及其礦化起到特殊的作用。將小鼠D3胚胎干細胞以單細胞懸液直接鋪板，培養過程中添加抗壞血酸、地塞米松和β-甘油磷酸鹽。誘導培養14 d，通過檢測成骨細胞特異性的標志物，如茜紅S染色、堿性磷酸酶活性分析和Bglap、Runx2基因表達作為檢測終點。經8種胚胎毒性化合物和4種已知誘發骨骼損傷的化合物的驗證研究表明，以成骨細胞分化為終點的方法與經典的EST方法相關性較好[11]。

3.4基因表達譜

把分子生物學技術應用于EST檢測，可提高效率和預測能力。最開始嘗試把某個分子作為檢測終點，后來嘗試把多基因和通路調節作為鑒別發育毒性的方法。例如，基因組學技術發現，未經化合物暴露的ESC分化培養物中38個基因上調，而經發育毒物暴露24 h發現特定基因表達的下調。采用連續的基因分析技術，實時檢測ESC的分化基因，鑒別出26個與發育毒性相關的分化基因，稱為EST生物標志物。用基因指紋方法預測單一劑量發育毒性，與體內一致性達67%[12]。在檢測時間方面，如果以經過篩選出的16個分化基因標志物的表達為檢測指標代替形態學觀察，可縮短檢測時間為5 d[5]。這些基因涉及外胚層形成(Nrcam,Nes,Shh和Pnpla6)、內胚層形成(Flk1和Afp)、中胚層形成(Mesp1,Vegfa,Myo1e和Hdac7)和一般的細胞發生(Cdk1,Myc,Jun,Mixl,Cer和Wnt3)。采用的指標為使目的基因表達下降50%的化合物濃度。

3.5信號通路

2009年，Uibel等人開發了ReProGlo方法，利用基于干細胞建立的體外系統預測藥物和化學品的胚胎毒性。通過熒光素酶報告基因檢測藥物引起的Wnt/β-catenin信號通路改變，后者是生物早期胚胎發育過程中極為保守的轉導通路。經改良后的方法可以高通量的同時檢測細胞活性和熒光素酶報告基因活性，試驗過程僅需3 d。該方法在歐盟ChemScreen計劃項目內經過了擴大范圍的測試研究[13]，經檢測的化學物質從17種擴大到了80種，并結合了化合物的結構分析，其預測模型為：① 陽性：化學物對Wnt信號有特異性影響，無細胞毒性或只在更高一級濃度才有細胞毒性；② 陰性：不管化合物有無細胞毒性，都對Wnt信號通路無影響；③ 非特異性陽性：化學物對Wnt信號有特異性影響，同時也具有細胞毒性。優化后的ReProGlo方法預測胚胎毒性的假陽性率比較低，適用于藥物開發早期的先導物設計和化合物胚胎毒性大規模篩查，對于其相對較高的假陰性率，不適合單獨用于監管目的。3.6蛋白組學方法

蛋白組學方法可用于監測D3細胞向心肌細胞的分化，記錄心肌分化過程中心肌蛋白的表達，其中最主要的是肌球蛋白重鏈和肌動蛋白。采用類似技術發現已知的早期神經發育標志 β3微管蛋白(β3 Tubulin Tuj-1)的表達可作為EST方法的檢測終點，適用于甲基汞類物質的測試。D3細胞分化過程中暴露于胚胎毒物，經全蛋白組學分析發現其中57種蛋白上調和42種蛋白下調，大多數上調蛋白與心肌細胞的功能相關，而下調蛋白主要為多能性標志蛋白、伴侶蛋白和核糖體蛋白。表明在轉錄組水平，相關基因的表達與蛋白質水平呈正相關，這也說明蛋白質組可作為EST的檢測終點[14]。

4檢測方法的量化和高通量

ECVAM驗證的EST試驗過程長，操作較為復雜，通常采用24孔板觀察反應終點，由于每種化合物需要設置幾種不同的濃度，工作量非常大。而且用跳動的胚胎體為定量檢測參數，精確度不高。如果采用低粘附性96孔版代替傳統懸滴實驗進行ES細胞向心肌細胞分化抑制實驗，并采用自動測試心肌細胞跳動的儀器簡化步驟，可建立高通量的EST實驗方法以提高檢測效率。再如用流式細胞檢測心肌細胞分化早期的特異蛋白質(肌球蛋白重鏈和肌動蛋白)，代替分化后期出現的心肌纖維跳動，可縮短檢測時間到7 d。如果以血管生成紊亂作為EST的終點，采用基因技術可建立檢測心肌細胞血小板內皮細胞粘附分子(Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule 1，PECAM-1)和血管內皮鈣粘素基因(VE-Cadherin)表達變化的方法，這兩個基因與心肌跳動呈線性相關。另外兩個心肌的標志物，如NK2同源框和肌球蛋白重鏈基因表達分析也可作為D3細胞向心肌細胞分化的檢測終點。此外，采用轉染Hand1和Cmyal基因的D3細胞進行EST檢測，可實現檢測的高通量，但其缺點是只能檢測心肌方向的分化[8-9]。這些高通量方法中，基于流式技術的EST方法正處于驗證過程中[1]。修訂后的SN標準也補充了這一相對成熟的技術。

5組合策略的應用

EST試驗、全胚胎培養試驗和斑馬魚模式動物試驗是目前體外預測發育毒性的主要方法，這些方法都有其適用范圍和局限性。Sogorb等建立了分層的發育毒性測試策略，可以利用這些體外方法評價發育毒性，并根據測試需要逐漸增加模型的復雜性、技術復雜性和費用。第一步為短期的細胞水平測試，以測定胚胎早期分化階段的作用；第二步為較長時間的細胞水平的胚胎毒性測試，以研究對胚胎后期發育產生作用的毒物；如果前兩步的試驗結果均為陽性，則可以考慮受試物為胚胎毒物，如果為陰性，則需要進行第三步的試驗，即考慮使用胚胎體的測試，如全胚胎試驗和斑馬魚模型，根據整個胚胎的分子和形態學的改變進行危害識別，而不只是以細胞的分化為指標[15]。短期的細胞水平的胚胎毒性預測主要為試驗周期小于5 d的改良EST試驗，如基于區分EST功能的基因組學方法[5]，EST早期化學物暴露中基因的下調和活性測試，ES D3細胞的轉錄組學測試[12]，神經性EST的轉錄組學方法等[14]。長期的細胞水平胚胎毒性試驗以試驗周期超過6的EST方法為主，如經典的EST試驗、血管生成分化作用和基因鑒別試驗[5]、化學發光EST試驗[8]、EST結合蛋白組學的方法、人胚胎干細胞的試驗[2]等。但這樣的組合模式，應建立在每個方法標準化的基礎上，而且需要大規模的數據解讀，目前尚處于開發階段，也缺少必要的決策判定步驟。

Panzica-Kelly等開發了僅用D3細胞和兩個終點評估化合物胚胎毒性的決策樹模型，分別是細胞活性改變50%(<22 μm,22 μm～200 μm或>200 μm 3個濃度)，且在此濃度下能引起一組12個發育調控的目的基因至少8個基因下調10%以上，該決策樹能正確預測65個化學物中45個化合物為致畸物，其優點是縮短檢測時間為4 d，且只需一種細胞的測試，缺點是只能提供有或無胚胎毒性的分類，而不是傳統EST方法的三分類。

組合測試策略的目的是使用較少的方法，實現對人發育/胚胎毒性最大程度的預測。目前的組合策略研究，不但組合了不同種屬來源的細胞水平測試(如Mes、hESC和iPS)，組合了不同水平的測試(形態學觀察、基因組和蛋白組水平)，還組合了不同適用范圍化合物的測試(神經發育、心肌發育和骨骼發育等)。對組合中的單個方法的預測能力、適用范圍還缺少明確的驗證，不同方法間的分層次序、互補性、權重分析、決策程序也缺少足夠的數據支持。目前的整合策略研究更多的是一種探索，但其代表了利用ES細胞替代發育毒性動物實驗的研究方向。

6討論

替代實驗方法通常由試驗系統、檢測終點、檢測方法和預測模型4個基本要素組成，多數對于EST方法的改進都集中于這幾個要素。首先對于試驗系統，采用更復雜的或更接近人類胚胎發育過程的系統，能夠更好地反應人體發育的生物學過程的復雜性，從而提高檢測方法的預測性，如使用人來源的干細胞(如hESC、iPS或轉染人基因的測試系統)代替小鼠ES細胞的研究。其次，對于檢測終點的選擇仍以心肌分化為主，因為抑制心肌分化可以覆蓋約80%的胚胎毒性；因而大多數研究集中于心肌終點的前移，不管是分子水平、基因水平還是蛋白水平，但值得注意的是一旦檢測點前移，雖然有可能檢測周期有所縮短，但也可能會帶來準確性的下降，因為即使是心肌的分化也是多基因復雜調控的結果，對于檢測指標的組合需要大量的化合物測試才能達到傳統EST的預測水平。心肌以外的終點在胚胎發育過程中的權重還未完全了解，因而對于神經分化和骨分化終點的檢測仍是心肌分化終點的有益補充。第三，檢測方法的改進緊跟材料學、儀器和生物學技術的發展，例如借助培養板材料的發展可開發檢測場電位的方法、用低粘度96孔板培養可建立中通量的EST方法，應用高內涵成像技術可定量神經細胞分化的形態學、使用熒光素酶技術可將檢測終點進一步量化和自動化。其優點是及時運用現階段技術的發展成果，缺點是標準化程度有待提高。第四，對于預測模型的改進并沒有太多的進展，多數仍沿用EST方法的線性判別函數。需要關注的是如何把基于基因和蛋白水平的檢測終點(例如目的基因表達下降、熒光信號通路等)建立預測模型，并驗證預測模型的可靠性和科學性。最后，需要把這些測試方法與其它體外技術(如QSAR模型、專家系統)和其它方法(如全胚胎試驗、斑馬魚試驗)進行組合，嘗試建立整合策略和決策模型，以期實現更好地預測胚胎和發育毒性。

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〔修回日期〕2015-12-25

[基金項目]檢驗檢疫標準修訂計劃(2013B381r)；廣東省科技計劃項目(2015A030402005)。

[作者簡介]程樹軍(1971-)，男，研究員，研究方向：動物替代實驗方法開發與標準化。E-mail: chengsj@126.com。

【中圖分類號】R-332【

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2016) 01-0081-04

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2016.001.016

Progress for alternatives methods predict the embrytoxicity by embryonic stem cell test

CHENGShu-jun1,2, QIN Yao3，YU Huan4，CHEN Yu1，3

(1. Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center，Guangzhou 510623，China；2. Guangdong Key Laboratory of Import and Export Technical Measures of Animal，Plant and Food，Guangzhou 510623，China；3.Guangzhou Calt Biotech.Ltd，Guangzhou 510623，China；4. School of Public Healty，Sun Yat-sin University，Guangzhou 510080，China)

【Abstract】Embryonic Stem cell Test(EST) is an alternative testing method for testing embryotoxicity and developmental toxicity which have been validated by the European Centre for Validation of Alternative Methods(ECVAM).Under the promote of new technology, EST method has been refined by many ways including gene transfection, utilizing human-derived stem cell, increase the assay throughput, integrating test endpoints and quantifying the test indexs,which enhanced scientific relevance and testing efficiency.Within the principle of integration testing strategy(ITS),conducting pre-validation tests and standardized experiments on a large scale of chemicals, the new EST method as a individual test or a part of integrated test systerm is promising to apply on the research of lead drugs and the embryotoxicity prediction and mechanism study of chemicals.

【Key words】Embryonic stem cell test；Embryotoxicity and developmental toxicity；Alternative method；Predictive