全基因組測(cè)序在細(xì)菌耐藥性分析中的應(yīng)用

李 秀，強(qiáng) 斌，徐正中，孟 闖，陳 祥，焦新安

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全基因組測(cè)序在細(xì)菌耐藥性分析中的應(yīng)用

李 秀，強(qiáng) 斌，徐正中，孟 闖，陳 祥，焦新安

細(xì)菌耐藥性特別是多重耐藥性已經(jīng)成為全球共同關(guān)注的問(wèn)題，其嚴(yán)重威脅疾病的治療，并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)的耐藥性分析方法耗時(shí)耗力，全基因組測(cè)序作為一種新型技術(shù)，可能會(huì)成為一種簡(jiǎn)單、快速和高效的耐藥性分析方法，且具有較好的敏感性和特異性。除了在已知耐藥基因型確定和耐藥表型預(yù)測(cè)外，該方法還可發(fā)現(xiàn)新的潛在的耐藥基因。現(xiàn)對(duì)全基因組測(cè)序在細(xì)菌耐藥性中的應(yīng)用作一綜述。

耐藥性；全基因組測(cè)序；耐藥基因

細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題在抗菌藥物應(yīng)用初期就受到關(guān)注。20世紀(jì)40年代青霉素開始應(yīng)用于臨床，幾乎在同一時(shí)期就發(fā)現(xiàn)青霉素酶的存在，細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題開始出現(xiàn)[1]。抗菌藥物僅僅使用70多年，很多曾經(jīng)可以輕易治療的細(xì)菌感染疾病現(xiàn)在已經(jīng)很難治療。當(dāng)前，全球細(xì)菌耐藥性問(wèn)題仍以驚人的速度在加劇，但幾乎沒(méi)有成功用于治療的新藥物產(chǎn)生，很多曾經(jīng)可以用一種藥物治療的傳染病目前已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生安全問(wèn)題[2]。耐藥性，特別是多重耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，給人和動(dòng)物疾病的治療帶來(lái)極大的困難[3]。

目前，常用的耐藥性研究方法主要從基因型和表型兩方面進(jìn)行。PCR是常用的基因型檢測(cè)方法，主要用于檢測(cè)已知的耐藥基因及其突變情況。藥物敏感性試驗(yàn)作為表型檢測(cè)方法，只能檢測(cè)有限的抗菌藥物，且耗時(shí)耗力，尤其是某些需要特殊生長(zhǎng)環(huán)境的細(xì)菌[4]。這些傳統(tǒng)的分析方法能幫助我們掌握細(xì)菌耐藥情況，但各有其受限之處。

基因組包含生物體的全部遺傳信息，基因組測(cè)序技術(shù)能夠直接反映基因組DNA的遺傳信息，不僅為基礎(chǔ)研究提供重要信息，也對(duì)基因組研究、藥物研發(fā)和基因治療等領(lǐng)域產(chǎn)生巨大的推動(dòng)作用。

1 全基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展

自上世紀(jì)70年代中期第一代DNA測(cè)序技術(shù)出現(xiàn)，至今已發(fā)展出第3代測(cè)序技術(shù)，30多年期間DNA測(cè)序技術(shù)已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進(jìn)展。

第1代測(cè)序技術(shù)成本高、速度慢，并不是理想的測(cè)序技術(shù)，目前采用的主要是2代測(cè)序技術(shù)，其以高通量、低成本為重要特征，主要包括Roche公司的454測(cè)序技術(shù)[5]，Illumina公司的Solexa測(cè)序技術(shù)[6]和ABI公司的SOLiD測(cè)序技術(shù)[7]。Roche 454技術(shù)和Solexa技術(shù)是聚合酶合成測(cè)序法，SOLiD則是連接酶合成測(cè)序法。第2代測(cè)序技術(shù)雖然在各方面都取得了較大的進(jìn)展，但由于其是建立在PCR基礎(chǔ)上，仍會(huì)帶來(lái)偏差[8]。

目前最新的第3代測(cè)序技術(shù)是單分子實(shí)時(shí)測(cè)序。Helicos公司推出的遺傳信息分析系統(tǒng)(Heliscope/ helicos Genetic Analysis System)[9]、Pacific Biosciences公司推出的SMRT技術(shù)和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子技術(shù)[10]，標(biāo)志著第3代測(cè)序技術(shù)的誕生。與前兩代測(cè)序技術(shù)相比，3代測(cè)序技術(shù)的成本大大降低。

2 全基因組測(cè)序在耐藥性分析中的應(yīng)用

過(guò)去十年，測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使臨床微生物學(xué)有了革命性的進(jìn)展。近來(lái)研究表明，全基因組測(cè)序分析可能在細(xì)菌耐藥基因型確定和預(yù)測(cè)耐藥表型中成為一種簡(jiǎn)單、快速和高效的方法，并且有較高的敏感性和特異性[4]，這使得可培養(yǎng)微生物的耐藥性分析實(shí)現(xiàn)了“一步法”，且分析周期短于1 d[11]。

2.1 在革蘭陰性菌耐藥性分析中的應(yīng)用 Stoesser等[11]利用Illumina HiSeq2000對(duì)74株大腸桿菌(Escherichiacoli)和69株肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)進(jìn)行全基因組測(cè)序，分析其對(duì)阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、頭孢曲松、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、慶大霉素和美羅培南7種常見抗菌藥物的耐藥性。將全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)用基于BLASTn的方法與包含染色體和質(zhì)粒的多于100個(gè)已知耐藥基因的基因庫(kù)進(jìn)行比較預(yù)測(cè)，并與肉湯稀釋法得到的表型結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示敏感性為0.96(95%CI: 0.94-0.98)，特異性為0.97(95%CI: 0.95-0.98)，并且得到一系列的耐藥基因：blaCTX-M、blaLEN、blaOKP、blaOXA、blaSHV、blaTEM、aac(3′)-Ia、aac-(3′)-IId、aac-(3′)-IIe、aac(6′)-Ib-cr、aadA1a、aadA4、aadA5、aadA16、aph(6′)-Id、aph(3′)-Ia、qnrB、qnrS以及染色體上喹諾酮耐藥決定區(qū)域基因gyrA和parC。

Sima等[12]也利用全基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)一株來(lái)自黎巴嫩病人的產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯氏菌進(jìn)行測(cè)序分析，并利用RAST在線注釋服務(wù)器進(jìn)行自動(dòng)注釋。結(jié)果顯示該菌株含有不同的β-內(nèi)酰胺類耐藥基因，包括blaOXA-1、blaCTX-M-15、blaSHV-11和blaTEM-1b。此外，該菌株中還檢測(cè)到其它共存基因，其中最值得關(guān)注的是acc(6′)-lb-cr和qnrb1。

Teresa等[13]利用全基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)一株多重耐藥的海藻希瓦菌(Shewanellaalgae)MARS14的耐藥基因組(resistome)和毒力因子進(jìn)行分析。該菌株對(duì)阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸和頭孢西丁表現(xiàn)耐藥，序列分析顯示該菌含有ampC和blaOXA-55基因。雖然該菌株對(duì)氟喹諾酮類藥物(如環(huán)丙沙星)表現(xiàn)敏感，但含有qnr4基因。此外，該菌株基因組中還分析得到15種耐藥結(jié)節(jié)分化外排泵、3種多重耐藥外排蛋白家族和80種ABC結(jié)合超家族。

Zhao等[4]則利用全基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)82株空腸彎曲桿菌和32株結(jié)腸彎曲桿菌(Campylobacterspp)的耐藥基因型進(jìn)行預(yù)測(cè)，并評(píng)價(jià)其與藥物敏感性試驗(yàn)得到的耐藥表型之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，其中108株四環(huán)素耐藥菌株全部含有tetO基因，敏感菌株則不含該基因，基因型與表型符合率為100%。同樣，萘啶酸/環(huán)丙沙星的符合率也為100%。在78株對(duì)慶大霉素耐藥菌株中，76株含有aac(6′)-Ie/aph(2″)-Ia、aac(6′)-Ie/aph(2″)-If、aph(2″)-Ib、aph(2″)-Ic、aph(2″)-Ig、aph(2″)-If或aph(2″)-Ih基因中的一個(gè)，1株含有aph(2″)-If和aac(6′)-Ie/aph(2″)-Ia2個(gè)耐藥基因。耐藥菌株的基因型和表型符合率為98.7%(77/78)，而其敏感性菌株的符合率為100%。當(dāng)然，也存在其它一些基因型和表型符合率存在差異的情況，如阿奇霉素、克林霉素和泰利霉素。全部菌株基因型和表型的總符合率高達(dá)99.2%(1 018/1 026)。

除了常見的革蘭氏陰性菌，2015年Nandagopal等[14]對(duì)一株來(lái)自人血液，表現(xiàn)多重耐藥的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)VRFPA09進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該菌株含有編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因blaVEB-1、blaOXA-10及多重耐藥和毒力因子的相關(guān)基因。對(duì)于已經(jīng)確定的基因型而言，全基因組測(cè)序技術(shù)具備直接確定基因型并預(yù)測(cè)耐藥表型的功能。

2.2 在革蘭陽(yáng)性菌耐藥性分析中的應(yīng)用 全基因組測(cè)序技術(shù)在革蘭陽(yáng)性菌耐藥性分析中的應(yīng)用主要集中在結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)。WHO將清除結(jié)核病的時(shí)間定在2035年，而結(jié)核分枝桿菌的多重耐藥性是完成此目標(biāo)的最大障礙[15]。利用全基因組測(cè)序不僅能夠篩選到已知的耐藥相關(guān)基因簇，還可用來(lái)確認(rèn)潛在性或者未知的基因簇[16]。Timothy等[15]對(duì)2 099株結(jié)核分枝桿菌的基因組進(jìn)行了測(cè)序，將23個(gè)耐藥基因作為候選基因，并從算法上將基因突變分為非耐藥因子、耐藥因子以及未確認(rèn)因子，評(píng)估其預(yù)測(cè)1 552個(gè)獨(dú)立候選基因組的藥物敏感性表型的能力，用于尋找在相似選擇壓力下除已知耐藥因子以外的突變候選基因，從而來(lái)解釋其余的未解耐藥表型。結(jié)果確認(rèn)了120個(gè)突變?yōu)槟退幰蜃雍?22個(gè)為非耐藥因子，其中89.2%的確認(rèn)表型可以被預(yù)測(cè)，敏感性和特異性分別為92.3%(95% CI: 90.7-93.7)和98.4%(95% CI: 98.1-98.7)；另外10.8%的表型無(wú)法被預(yù)測(cè)，主要是由于出現(xiàn)未知的突變。大量已知的基因突變使得全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)可以在臨床中預(yù)測(cè)耐藥或敏感，或者確認(rèn)不能通過(guò)基因型預(yù)測(cè)的表型。這種方法可以替代藥物敏感性試驗(yàn)，并已被應(yīng)用到常規(guī)的診斷過(guò)程中以便更快地獲取耐藥表型。如英國(guó)公共衛(wèi)生組織已將全基因組測(cè)序技術(shù)作為“一步法”診斷分枝桿菌感染的可能性。全基因組測(cè)序在多重耐藥的結(jié)核病上具備實(shí)現(xiàn)“個(gè)體化”治療的潛在可能[17]。Keira等[18]利用全基因組測(cè)序?qū)?lái)自夸祖魯-納塔爾的337株臨床菌株進(jìn)行分析，以確認(rèn)結(jié)核病的普遍耐藥性是最近產(chǎn)生的還是逐漸演化而來(lái)。在我國(guó)，Zhang等[19]也對(duì)一株來(lái)自江蘇無(wú)錫的多重耐藥北京/W型結(jié)核分枝桿菌(W146)進(jìn)行測(cè)序，該菌株包含幾乎所有耐藥性關(guān)基因及其突變，如rpoB(S531L)、rpsL(K43R)、gidB(E92D)、embB(M306I)以及gyrA基因等。

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)表明許多地區(qū)的結(jié)核分枝桿菌突變體具有區(qū)域性特征[20]，表明對(duì)耐藥基因突變進(jìn)行分類至關(guān)重要。目前常用的基于PCR的分類方法需要大量重復(fù)性工作，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且分辨率較低，無(wú)法區(qū)分親緣關(guān)系較近的結(jié)核分枝桿菌。Hiroki等[21]建立一種基于SNP(single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性)串聯(lián)體的針對(duì)結(jié)核桿菌的在線服務(wù)器，CASTB(comprehensive analysis server for theMycobacteriumtuberculosiscomplex，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群綜合分析服務(wù)器)，可用于流行病學(xué)分析、耐藥性預(yù)測(cè)和系統(tǒng)進(jìn)化分析(http://castb.ri.ncgm.go.jp/CASTB/index.html)。Francesc等[22]則建立了針對(duì)15種抗菌藥物，包含1 325個(gè)突變體的預(yù)測(cè)性基因庫(kù)，其中11種抗菌藥物已經(jīng)被792株菌株的全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)證明，同時(shí) “TB-Profiler”在線方法也證明該基因庫(kù)優(yōu)于其它常規(guī)診斷方法和其他已建立的耐藥基因庫(kù)。

除了在結(jié)核分枝桿菌中研究較為廣泛，全基因組測(cè)序技術(shù)也在其它革蘭陽(yáng)性菌株中得到應(yīng)用。如Kok-Gan等[23]對(duì)一株來(lái)自慢性阻塞性肺炎病人的溶血性葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)C10A進(jìn)行了測(cè)序，并利用未加工的基因組序列發(fā)現(xiàn)其潛在的多重耐藥因子和毒力因子，該菌株包含針對(duì)氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、青霉素類、四環(huán)素類和糖肽類藥物的多種耐藥因子。

3 小 結(jié)

隨著DNA測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，其已經(jīng)在流行病學(xué)診斷和藥物敏感性預(yù)測(cè)等方面得到廣泛應(yīng)用，研究對(duì)象也由簡(jiǎn)單的單個(gè)或幾個(gè)基因及其作用轉(zhuǎn)為全基因組的結(jié)構(gòu)和功能。由于耐藥性自身及受到環(huán)境等外界因素影響的復(fù)雜性，傳統(tǒng)研究方法已無(wú)法滿足要求。全基因組測(cè)序技術(shù)能夠分析得到耐藥基因及其突變情況，除了已知的耐藥機(jī)制，還可用于預(yù)測(cè)未知的潛在耐藥機(jī)制，耐藥基因的表達(dá)決定著細(xì)菌耐藥性，因此該方法可以更好地為解決耐藥性問(wèn)題提供重要參考，全基因組測(cè)序技術(shù)未來(lái)可能超越常規(guī)方法成為耐藥性研究的首選工具之一，在尋找降低細(xì)菌耐藥性的新方法和研發(fā)新藥物中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，并更加廣泛地應(yīng)用到疾病的診斷及治療中。

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s: Chen Xiang, Email: chenxiang@yzu.edu.cn; Jiao Xin-an, Email: jiao@yzu.edu.cn

Application of whole genome sequencing in bacterial antimicrobial resistance

LI Xiu, QIANG Bin, XU Zheng-zhong, MENG Chuang, CHEN Xiang, JIAO Xin-an

(JiangsuKeyLaboratoryofZoonosis/JiangsuCo-InnovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)

Bacterial antimicrobial resistance, particularly multidrug resistance, has threaten public health and caused huge economic losses in the world.While many traditional antimicrobial resistance analysis methods are time-consuming, the whole genome sequencing, a new technology, could be a simple, rapid and efficient method applied to antimicrobial resistance analysis with great sensitivity and specificity. In addition to identifying the conventional resistant genotypes and predicting resistant phenotypes, this method may also find the potential resistance mechanisms. This article will review the research progress of whole genome sequencing application in bacterial antimicrobial resistance analysis.

antimicrobial resistance; whole genome sequence; resistance gene

陳 祥，Email：chenxiang@yzu.edu.cn；

焦新安，Email：jiao@yzu.edu.cn

揚(yáng)州大學(xué), 江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009

Supported by the National Department Public Benefit Research Foundation (No. 201403054), the Jiangsu Innovation Program for Graduate Education (No. KYLX_1340), the Qing Lan Project and Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (No. PAPD).

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.003

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A

1002-2694(2016)08-0696-04

2016-05-11；

2016-06-20

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(No.201403054)；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(No.KYLX_1340)；江蘇高校‘青藍(lán)工程’和優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目(No.PAPD)聯(lián)合資助