鐵載體對肺炎克雷伯菌毒力增強的機制研究

陳 楊， 劉嘉琳， 瞿洪平

·綜述·

鐵載體對肺炎克雷伯菌毒力增強的機制研究

陳 楊， 劉嘉琳， 瞿洪平

肺炎克雷伯菌； 毒力因子； 鐵載體

肺炎克雷伯菌是醫院和社區獲得性感染中最常見的革蘭陰性致病菌之一，可引起肺炎、尿路感染、血流感染等。自1986年中國臺灣首先報道肺炎克雷伯菌引起的社區獲得性肝膿腫伴多發轉移性膿腫后，國內外多所醫院相繼從肝膿腫患者分離出肺炎克雷伯菌，肺炎克雷伯菌導致的肝膿腫中高達78.3 %為亞洲患者[1]，這種肺炎克雷伯菌變異株被稱為高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumonia， hvKP）。與經典肺炎克雷伯菌（classic Klebsiella pneumonia， cKP）不同，hvKP具有高黏液性的特點，可引起健康青壯年的嚴重感染，使患者重要臟器發生化膿性感染（如肝膿腫）[2]，并且容易轉移播散至腦脊液、眼、脾臟等其他部位[3-5]。正是由于hvKP導致的高致病性、高傳播性以及高病死率，更突顯了對肺炎克雷伯菌致病性研究的重要性和緊迫性[6]。目前研究認為，與肺炎克雷伯菌致病性相關的特征性毒力因子主要有莢膜多糖、脂多糖、菌毛、生物膜及鐵載體等，其中莢膜多糖的合成增加與通過鐵載體獲得鐵效率的增加共同組成肺炎克雷伯菌毒力增強的主要因素[7]，但其具體致病機制尚未完全明了，特別是鐵載體在肺炎克雷伯菌毒力增強方面的研究成為普遍關注的亮點。

對于大多數生物來說，鐵是其生長所必須的重要元素。鐵作為輔助因子在生化代謝反應、電子傳遞等生命活動過程中發揮重要作用[8]。但三價鐵離子（Fe3+）及其衍生物溶解性較低，大多數微生物難以直接利用，需通過合成并分泌鐵載體來滿足細菌對鐵的需求并參與細菌生長與代謝。近年研究表明，病原微生物的鐵載體還與它們的毒力相關，因為病原菌從宿主體內吸收鐵是其繁殖和感染的必要步驟。通過鐵載體獲得鐵的過程對肺炎克雷伯菌導致健康人群侵襲性感染的能力極為重要。實驗感染模型顯示許多產碳青霉烯酶（KPC）的肺炎克雷伯菌克隆菌株ST258/ST11即在肺炎克雷伯菌CC258中的耶爾森菌素增加了細菌在呼吸道定植和引發肺炎的能力[9-10]。這種具有耐藥性的高毒力菌株導致治療手段的缺乏，加大了臨床治療的難度。肺炎克雷伯菌表達多種鐵載體以增強其在鐵缺乏環境中獲得鐵的能力，其中已報道與毒力密切相關的鐵載體系統有氣桿菌素、腸桿菌素、沙門菌素和耶爾森菌素4種[11]，本文分別從蛋白和分子水平對這4種鐵載體系統綜述如下。

1　鐵載體概述

鐵載體是微生物在低鐵條件誘導下合成的一類低分子量化合物，對Fe3+有特異的高親和力，在微生物界分布廣泛，種類和生物活性多樣。微生物合成鐵載體的同時在細胞外膜上產生特定受體蛋白即鐵受體蛋白，它可以特異識別Fe3+-鐵載體，將Fe3+輸送到細胞內。鐵載體及其特異性受體的生物合成需多個基因編碼完成，這些基因通常在細菌染色體或質粒上組成一個基因簇。絕大多數微生物都可以合成鐵載體，根據螯合鐵的功能基團化學結構的不同，可將其分為4種類型即氧肟酸鹽型、鄰苯二酚鹽型、羧酸鹽型和混合型。細菌可以產生各種類型的鐵載體，其中氧肟酸鹽和鄰苯二酚鹽型鐵載體在腸桿菌屬中較常見，而絕大多數真菌只合成氧肟酸鹽型鐵載體。根據鐵載體的不同類型現已發展了多種檢測鐵載體的方法[12-14]。其中，鉻天青（CAS）檢測法由于其快速、靈敏、準確等優點成為目前最普遍應用的檢測方法。CAS檢測法不依賴于鐵載體的結構，而是通過鐵載體與Fe3+螯合作用產生的顯色反應來定性、定量測定鐵載體。鐵載體的功能多樣，對微生物的鐵營養起至關重要的作用，也是某些病原菌的毒力因子。病原菌通過高效的鐵攝取系統從宿主細胞中獲取鐵，從而實現毒力作用：首先，病原菌合成的鐵載體大多數與宿主轉鐵蛋白中的鐵結合形成Fe3+-鐵載體復合物，由細菌外膜上的鐵受體蛋白識別并將鐵釋放入細胞內，使胞內Fe3+濃度增加，促進細菌生長繁殖，造成細菌感染加重或擴散；此外，鐵載體還可催化羥基自由基生成，進一步加重組織損傷，輔助細菌的生長繁殖[15]。

2　增強肺炎克雷伯菌毒力相關的鐵載體類型和特點

研究表明，在加入人類腹水的培養基或貧鐵的基本培養基上培養hvKP和cKP，鐵載體定量試驗（CAS檢測法）測得毒力更強的肺炎克雷伯菌均可分泌數量更多、活性更強（可能為細菌結合利用鐵的效率增加和細菌對宿主的抵抗力增強）的鐵載體，這可能是肺炎克雷伯菌增強其毒力的重要機制[16-17]。4種鐵載體系統的氣桿菌素、腸桿菌素、沙門菌素和耶爾森菌素，在肺炎克雷伯菌毒力增強中發揮的作用和特點各有不同。

2.1氣桿菌素

氣桿菌素是大多數腸桿菌科病原體分泌的一種氧肟酸鹽與羧酸鹽混合型鐵載體蛋白，與鐵親和力較低。在侵襲性感染的過程中細菌與宿主組織的關系密切，而研究發現氣桿菌素主要從宿主組織細胞中運載鐵，這可能是侵襲性菌株更容易分泌氣桿菌素的原因[15]。雖然肺炎克雷伯菌自身不能合成氣桿菌素，但它可以高效利用其他微生物合成的氣桿菌素。有研究者通過PCR擴增技術比較hvKP和cKP中編碼氣桿菌素及其受體基因簇（iucABCD-iutA）的分布情況，發現基因簇在hvKP中更普遍存在[11]，說明肺炎克雷伯菌毒力增強可能是由于氣桿菌素產量的增加。盡管hvKP中氣桿菌素產量增加的機制目前仍不清楚，但已經明確在鐵貧乏的條件下氣桿菌素是hvKP鐵載體蛋白含量增加的主要因素，并且氣桿菌素是hvKP鐵載體中最重要的毒力因子。RUSSO等[16，18]報道，把hvKP與cKP分別在加入人類腹水的合成培養基或貧鐵的基本培養基上培養，定量測定鐵載體蛋白總產量，結果發現hvKP鐵載體蛋白總產量增加更為顯著，且通過質譜分析法測得其中氣桿菌素產量占鐵載體蛋白總產量的90 %；在小鼠腹腔內注射hvKP的感染模型中，單獨敲除氣桿菌素編碼基因的小鼠存活率明顯高于野生型小鼠和分別單獨敲除其余鐵載體合成基因的小鼠，進一步說明氣桿菌素是hvKP鐵載體中最重要的毒力因子。細菌毒力的增強大多是因為基因的水平性轉移，研究發現iucABCD-iutA、亞碲酸鹽抗性因子（TerW）、黏液表型調節因子（RampA）和銀抗性因子（SilS）等因子的編碼基因在大小約220 kb的毒力質粒上同時存在，水平獲得此毒力質粒的肺炎克雷伯菌毒力增強，更易引起宿主形成肝膿腫等嚴重的轉移性感染[19]。

2.2腸桿菌素

腸桿菌素是腸桿菌科病原體（包括肺炎克雷伯桿菌）產生的一種最常見的典型鄰苯二酚鹽型鐵載體蛋白。與其他已知的鐵載體蛋白相比，腸桿菌素具有最高的鐵親和力[20]，主要與血漿轉鐵蛋白中的鐵結合，促進細菌生長而引起細菌感染。為了阻礙腸桿菌素結合鐵，宿主的中性粒細胞和黏膜上皮細胞產生固有免疫蛋白Lcn2螯合腸桿菌素，抑制血管周圍細菌的定植生長，防止感染的播散，間接表明腸桿菌素可能對于深部組織的穿透性感染有重要作用[9]。肺炎克雷伯菌的臨床分離株均可合成腸桿菌素，其合成基因簇為entABCDEF[11]。雖然腸桿菌素在動物模型中的感染機制尚不清楚[21]，但其合成基因entB的表達過多可產生更多的鐵載體使細菌獲得更多的鐵，而細菌內環境中鐵的增加能促進生物膜的早期形成使hvKP毒力增強[22-23]，這間接說明腸桿菌素的增加使肺炎克雷伯菌毒力增強。

2.3沙門菌素

沙門菌素為大腸埃希菌、沙門菌和克雷伯菌產生的一種鄰苯二酚鹽型鐵載體蛋白，可被看作糖基化的腸桿菌素，具有較高的鐵親和力[24]。宿主產生的固有免疫蛋白Lcn2不能與沙門菌素結合，從而使沙門菌素可以螯合鐵促進細菌的復制，造成細菌感染加重或擴散，增強細菌對宿主的毒力作用[25-26]。在細菌感染過程中鄰苯二酚鹽型鐵載體（包括腸桿菌素和沙門菌素）發揮特征性抗氧化劑的作用，催化羥基自由基的生成，加重對組織的損傷作用從而增強細菌的毒力[27]。沙門菌素由基因簇iroA（iroBCDN）編碼合成，沙門菌素和氣桿菌素的合成基因簇均位于一個大小約為200～220 kb的毒力質粒上，水平轉移性獲得此毒力質粒的肺炎克雷伯菌表達高黏液性表型，毒力增強引起機體嚴重的轉移性感染[28-30]。沙門菌素的受體蛋白由基因iroN編碼，iroN可調節腸桿菌素、沙門菌素等鐵載體蛋白的攝取，在細菌侵襲性感染時具有重要的輔助作用[31]。

2.4耶爾森菌素

耶爾森菌素是由耶爾森菌屬高致病性菌分泌的混合型鐵載體蛋白，其主要功能基團為酚鹽和羧酸鹽，具有中等的鐵親和力[32]。通過PCR擴增技術比較hvKP和cKP中編碼合成耶爾森菌素及其受體的基因簇分布情況，發現基因簇在hvKP中更普遍存在，說明hvKP毒力增強可能是由于耶爾森菌素產量的增加[11]。耶爾森菌素通過規避與宿主固有免疫機制相關蛋白（Lcn2）的結合造成呼吸道的嚴重感染[9]。在貧鐵條件下，耶爾森菌素通過激活外膜蛋白FyuA來促進生物被膜的形成從而增強細菌的毒力[33]。PAAUW等[34]報道耶爾森菌素和氣桿菌素通過阻斷活性氧的產生間接降低宿主固有免疫細胞的殺菌能力，從而增強細菌的毒力。對目前已測序的NTUH-K2044 hvKP菌株進行相關數據分析發現，耶爾森菌素在hvKP中由可移動的整合性結合元件（ICEKp1）上類似耶爾森鼠疫桿菌的強毒力島基因簇ybt、irp1、irp2、fyuA編碼合成、轉運和調節[29，35]。強毒力島（耶爾森菌素合成基因簇），iuc（氣桿菌素合成基因簇）和iroA（沙門菌素合成基因簇）區域與hvKP均密切相關，因此在cKP向hvKP進化的過程中以上基因簇可以作為水平獲得性毒力基因位點的代表[36]，從基因水平上解釋hvKP毒力增強的原因。

3　總結

在hvKP中廣泛存在的各種鐵載體蛋白使其較cKP具有更強的鐵離子獲取能力，并且這與hvKP的高毒力密切相關。在鐵貧乏的條件下，氣桿菌素一方面是hvKP鐵載體蛋白含量高的主要因素，另一方面也是hvKP鐵載體中最重要的毒力因子。盡管已有相關hvKP的鐵載體蛋白的研究，但很多機制依然無法闡釋，例如hvKP為何會分泌更多的鐵載體蛋白、感染發展不同時相對鐵載體蛋白產量的影響、鐵載體中最重要的氣桿菌素其哪些特征直接增強了肺炎克雷伯菌的毒力等這些問題都亟待解決。對肺炎克雷伯菌鐵載體運輸系統的研究，旨在闡明鐵載體利用與細菌毒力之間的關系，闡明鐵載體在引起感染過程中的內在機制和作用規律，進而達到抑制病原菌生長、預防疾病，拓寬治療途徑的目的，為臨床治療提供全面而有效的信息。

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Mechanistic research on the role of siderophores in enhancing the virulence of Klebsiella pneumoniae

CHEN Yang, LIU Jialin, QU Hongping. （Intensive Care Unit, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200020, China）

R378.996

A

1009-7708 ( 2016 ) 06-0804-04

10.16718/j.1009-7708.2016.06.025

上海交通大學“醫工交叉基金”（YG2014MS57）

上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院重癥醫學科，上海200020。

陳楊（1991―），女，碩士研究生，主要從事腸桿菌科細菌致病機制研究。

瞿洪平，E-mail: hongpingqu0412@hotmail.com。

2016-02-01

2016-03-24