光激化學發光免疫分析技術在仙臺病毒檢測中的應用

常　慧，高　偉，張江義，向志光，魏　強

(1.中國醫學科學院北京協和醫學院醫學實驗動物研究所，北京　100021；2.北京市中關村醫院，北京　100190)

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光激化學發光免疫分析技術在仙臺病毒檢測中的應用

常慧1，高偉2，張江義2，向志光1，魏強1

(1.中國醫學科學院北京協和醫學院醫學實驗動物研究所，北京100021；2.北京市中關村醫院，北京100190)

【摘要】目的應用光激化學發光免疫分析技術(AlphaLISA)建立仙臺病毒檢測方法。 方法 通過方陣實驗篩選仙臺病毒AlphaLISA檢測的最佳抗原濃度以及供體微珠與受體微珠的最佳受試濃度及比例，對大鼠血清進行測試，確立血清檢測濃度；對40份大鼠血清分別使用AlphaLISA檢測方法和ELISA檢測方法進行檢測，并對檢測結果進行比較。 結果 生物素化標記的仙臺病毒多肽類抗原的最佳測試濃度為250 nmol/L，供體微珠與受體微珠的最佳比例為1:1，使用濃度為20 μg/mL，在AlphaLISA檢測方法中大鼠血清測試最佳使用濃度1:10000；共檢測40份大鼠血清，ELISA方法檢出陽性7份，陽性率為17.5%，AlphaLISA方法檢出陽性8份，陽性率為20.0%，ELISA檢測陽性的7份血清經AlphaLISA方法檢測均為陽性，AlphaLISA檢出的另外一份樣品經IFA方法驗證為陽性。 結論 初步建立了仙臺病毒光激化學發光免疫分析技術(AlphaLISA)的檢測方法，該方法敏感性堪比經典ELISA方法，且血清樣本的用量減少，無需洗滌等步驟，在方法的簡并性及準確性上有一定優勢。

【關鍵詞】仙臺病毒；AlphaLISA

仙臺病毒(sendai virus，SV )是嚙齒類實驗動物常見的感染性病原體，對實驗動物自身有一定危害[1]，同時干擾動物實驗研究[2]。因此在國內外的實驗動物繁殖和使用機構，仙臺病毒是嚙齒類等實驗動物的必需排查的病毒[3-4]。

目前，國內外對于仙臺病毒的檢測多采用血清學的檢測方法，包括間接免疫熒光(IFA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)以及多通道熒光免疫分析(multiplexed flurometric immune assay，MFIA)等方法。然而這些方法仍存在一些問題：仙臺病毒天然抗原存在與其他病原體的交叉抗原，影響了檢測技術的特異性[5]；熒光檢測受到激發熒光背景值的影響，影響其特異性和敏感性；在現有的固相免疫和MFIA等方法中均存在多次洗滌步驟，增加了檢測體系的不確定性。

與仙臺病毒全病毒顆粒相比，多肽抗原的敏感性堪比ELISA檢測方法，其特異性更好，是仙臺病毒檢測較好的線性抗原[8]。

光激化學發光免疫分析技術(amplified luminescent proximity homogeneous assay，AlphaLISA)是近年來新近開發的一種基于增強化學發光的均相免疫檢測技術,在其檢測體系中存在著4類元件：待檢樣品B；與待檢樣品可特異結合的已知純化制品A；供體微珠，標記識別A分子；受體微珠，標記識別B的分子。A與B的特異性識別將供體微珠和受體微珠的距離拉近，用680 nm的激光激發供體微珠產生大量的單線態氧分子，這些分子將能量傳遞到受體微珠，從而誘導其波長615 nm的發射峰，光信號的強度在一定范圍反映反應體系中A、B的特異結合[6-7]。

本研究利用前期實驗篩選出的多肽抗原[8]初步建立了仙臺病毒的光激化學發光免疫分析技術(AlphaLISA)檢測方法，在方法的簡并性及準確性上有一定優勢，為進一步研究仙臺病毒檢測提供基礎。

1材料和方法

1.1材料和試劑

AlphaLISA樣品稀釋液，AlphaLISA Streptavidin Donor beads，AlphaLISA anti-Rat IgG Acceptor beads，384孔微孔板均購于美國PerkinElmer公司，檢測儀為美國PerkinElmer的Enspire多標記微孔板檢測系統。

生物素化仙臺病毒多肽參照之前方法制備，并增加生物素化標記[8]。大鼠陽性血清為仙臺病毒免疫血清，大鼠陰性血清為SPF大鼠仙臺病毒陰性血清。

1.2實驗方法

1.2.1預實驗初步確定抗原和血清稀釋度 將AlphaLISA buffer稀釋至工作濃度，作為樣品稀釋液，選總體系為20 μL。抗原濃度分別為100 nmol/L，500 nmol/L和血清使用濃度1∶100，1∶1000，供體微珠和受體微珠比例1∶1進行預實驗。

1.2.2最佳供體微珠和受體微珠比例的確定用抗原濃度100 nmol/L，血清濃度1∶100，分別用供體受體微珠比例為4∶1，1∶1，1∶2，1∶4比例進行檢測，分析檢測信號值，確定最適比例。

1.2.3AlphaLISA抗原、血清最佳使用濃度的確定將AlphaLISA buffer稀釋至工作濃度，作為樣品稀釋液，選總體系為20 μL。為了確定抗原及血清的最佳使用濃度，將抗原稀釋終濃度為0.75 nmol/L，7.5 nmol/L，75 nmol/L，250 nmol/L，500 nmol/L；血清終濃度1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000稀釋，抗原和血清各5 μL，并作空白對照，加入384孔板中，同時加入5 μL濃度為80 μg/mL，終濃度為20 μg/mL的受體微珠，1000 r/min離心1 min后37℃孵育60 min，避光加入供體微珠5 μL，終濃度為20 μg/mL，1000 r/min離心1 min后37℃孵育60 min后置于Enspire多標記微孔板檢測系統上檢測信號值。

1.2.4ELISA和IFA檢測方法大鼠仙臺病毒ELISA檢測方法參見本實驗室制備的仙臺病毒ELISA抗體檢測試劑盒檢測方法[10]。IFA方法采用實驗動物國家標準推薦方法[3-4]。

2結果

2.1預實驗初步確定抗原和血清稀釋度

用抗原濃度100 nmol/L，血清濃度1∶100時陽性對照血清和陰性對照血清信號值比值最高。

2.2最佳供體微珠和受體微珠比例的確定

在上述預實驗條件下，分別用供體受體微珠比例為4∶1，1∶1，1∶2，1∶4進行檢測，在供體受體比例為1∶1時，陰性血清信號值最低，且陽性血清與陰性血清信號值比值最高，最終確定供體受體比例為1∶1(20 μg/mL：20 μg/mL)(圖1)。

圖1　生物素化仙臺病毒多肽AlphaLISA供體受體最佳比例的確定 Fig.1　The optimization of donor/acceptor ratio for SV bio-peptide AlphaLISA assay

注：多肽使用濃度為a.0.75 nmol/L；b.7.5 nmol/L；c.75 nmol/L；d.250 nmol/L；e.500 nmol/L。圖2　生物素化仙臺病毒多肽AlphaLISA最佳抗原和血清使用濃度的確定Fig.2　The ptimization of the concentration of antigen and the serum working concentration for SV bio-peptide AlphaLISA assay

2.3最佳抗原使用濃度和最佳血清使用濃度的確定

將抗原稀釋終濃度為0.75 nmol/L，7.5 nmol/L，75 nmol/L，250 nmol/L，500 nmol/L；血清終濃度1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000稀釋,比較不同濃度時的信號值。結果顯示：在抗原濃度為75 nmol/L時，抗原與陽性血清具有較好的特異性反應，陰性血清信號值維持在較穩定的水平，且隨著抗原終濃度的增加，信號值呈上升趨勢，進而優化抗原終濃度為250 nmol/L，500 nmol/L，在抗原終濃度為500 nmol/L時，陰性對照信號值有明顯增高，確定抗原用量終濃度為250 nmol/L，250 nmol/L時，血清終濃度1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000稀釋時，陽性對照和陰性對照血清信號值比值均在有效范圍內，但是為了減少血清用量，選擇血清終濃度為1∶10000進行后續實驗。

2.4 AlphaLISA方法與ELISA檢測方法的比較

注：a.ELISA檢測結果；b.AlphaLISA檢測結果。圖3　 ELISA與AlphaLISA檢測方法的比較Fig.3　The comparison of ELISA and AlphaLISA assay. a.The results of the ELISA assay; b.The results of the AlphaLISA assay

共檢測大鼠血清40份，ELISA檢測出陽性血清7份，大鼠樣品中檢出仙臺病毒的陽性率為17.5%，AlphaLISA檢測中，以檢測值/陰性對照值≥2.1為判斷標準，檢出陽性血清8份，陽性率為20.0%，ELISA陽性的7份血清經AlphaLISA方法檢測均為陽性，如圖3所示，AlphaLISA檢出的另外一份陽性樣品經IFA方法驗證為陽性。

3討論

AlphaLISA技術是一種基于微珠的化學發光的新型均相檢測技術，與目前被廣泛使用的傳統的ELISA技術相比具有更高的精確性、靈敏度、均一性、背景低、無需洗滌、廣泛的動態檢測范圍以及樣本需求量極少等優點[5-7]，AlphaLISA 是均相技術，無洗滌步驟，操作簡單；長波長激發，短波長檢測，減低了反應背景；單體氧信號強，靈敏度高；單個微珠可結合200～300個抗體，可進行低親和力生物分子的檢測，檢測動態范圍較寬；反應體系小，樣品用量少。該技術可用于多種組織、細胞來源的生物分子的檢測,如細胞因子、抗原抗體的檢測、蛋白相互作用及蛋白質與核酸相互作用的檢測以及藥物分析等研究。國外已有使用AlphaLISA檢測炭疽芽胞桿菌的報道[7]。

與仙臺病毒全病毒顆粒相比，多肽抗原的敏感性堪比ELISA檢測方法，其特異性更好，是仙臺病毒檢測較好的線性抗原[8-9,11]。本研究采用生物素化多肽作為抗原，在對抗原和血清等條件進行優化后，初步建立了AlphaLISA檢測技術，并與ELISA檢測方法進行了比較研究，結果顯示，該方法在檢測敏感度、簡便性上依靠Alpha技術特有的均相熒光檢測技術較之目前常用的ELISA等方法有所提高，而且減少了血清樣本的用量，不用洗滌等步驟，和傳統方法相比具有一定優勢，為進一步研究仙臺病毒檢測提供基礎。

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〔修回日期〕2015-04-08

技術方法

Development of an amplified luminescent proximity

homogeneous assay for detecting Sendai virus

CHANG Hui1，GAO Wei2，ZHANG Jiang-yi2，XIANG Zhi-guang1，WEI Qiang1

(1.Insitute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences(CAMS)&Comparative Medicine Center,

Peking Union Medical College(PUMC). Beijing 100021，China；2.Zhongguancun Hospital, Beijing 100190，China)

【Abstract】ObjectiveTo establish the amplified luminescent proximity homogeneous assay(AlphaLISA) for the detection of Sendai virus. Methods The antigen concentration，serum concentration and the donor beads/acceptor beads ratio used in the AlphaLISA method were optimumized by the phalanx experiments, then the antibodies of Sendai Virus in 40 rat sera were detected by the established AlphaLISA method and ELISA detection method. The results were compared and the differentia between the two methods was confirmed by IFA. ResultsThe optimum concentration of SV bio-peptide in AlphaLISA assay was 250 nmol/L, the best proportion of donor beads/acceptor beads ratio was 1∶1,using the concentration of 20 μg/mL and the serum dilution was 1∶10000.7 of the 40 rat sera were detected SV positive by ELISA, the positive rate was 17.5%, 8 of the 40 rat sera were determined SV positive by AlphaLISA, and the positive rate was 20.0%, the AlphaLISA positive serum was confirmed by IFA. ConclusionsWe preliminary established the Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay(AlphaLISA) for the detection of Sendai virus. The sensitivity of the method is comparable to classical ELISA method, but this method use less serum samples and without washing steps. The method has some advantages in degeneracy and accuracy.

【Key words】Sendai virus；AlphaLISA

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.014

【中圖分類號】R332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 05-0058-04

[通訊作者]向志光，E-mail: xiangzg@cnilas.org；魏強，E-mail: weiqiang0430@sohu.com。

[作者簡介]常慧(1988-),女，碩士，E-mail: changhai9012@163.com。

[基金項目]協和青年基金和中央高校基本科研業務費專項資金資助(3332013042；33320140015)。