兩品系小鼠局部淋巴結試驗結果比較

胡培麗，張露勇，李　波，邢書霞

(中國食品藥品檢定研究院，北京　100050)

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兩品系小鼠局部淋巴結試驗結果比較

胡培麗，張露勇，李波，邢書霞

(中國食品藥品檢定研究院，北京100050)

【摘要】目的分析比較BALB/c和CBA小鼠局部淋巴結試驗結果。 方法 將已知致敏性的4種化學物(2,4-二硝基氯苯、丁子香酚、己基肉桂醛和異丙醇)和未知致敏性的3種化妝品對BALB/c和CBA小鼠連續染毒3 d，第5天腹腔注射示蹤劑BrdU，第6天分離頜下淋巴結制取單細胞懸液，用ELISA試盒檢測細胞增殖。 結果 2,4-二硝基氯苯、丁子香酚、己基肉桂醛和3號燙發劑兩品系結果均呈致敏陽性，3種化學物EC1.6值分別為0.08%(極強)、4.02%(中)、6.68%(中)(BALB/c)和0.07%(極強)、6.08%(中)、8.89%(中)(CBA)；異丙醇、1和2號化妝品兩品系結果均為致敏陰性，SI均小于1.6。 結論 兩品系小鼠局部淋巴結試驗結果較一致，BALB/c可替代CBA小鼠應用于化學物和化妝品的致敏性評價。

【關鍵詞】局部淋巴結試驗；品系；化妝品

小鼠局部淋巴結試驗(local lymph node assay，LLNA)是皮膚致敏性多種替代方法中應用最為廣泛的全球標準方法[1-3]，但該方法需要使用放射性標記物、特定的設備和實驗條件，不利于推廣；2010年OECD指南公布了基于摻入溴脫氧尿嘧啶核苷和酶聯免疫吸附測定的改良方法(LLNA:BrdU-ELISA)[4]，用示蹤劑替代放射性標記物，較易推廣。該指南中推薦使用CBA小鼠，由于該品系小鼠在國內供應量較少，價格昂貴，給國內很多學者開展該試驗帶來了一定的困難。鑒于國內外有使用BALB/c、NMRI、ICR、DBA/2、C57BL/6、SJL等品系的報道[5-10]，而BALB/c小鼠是國內應用較多的品系，遺傳穩定，本實驗嘗試分析比較國內BALB/c和CBA兩品系小鼠對LLNA:BrdU-ELISA實驗結果的影響，從而為LLNA實驗選擇合適的動物品系提供參考。

1材料和方法

1.1受試物

溶劑由丙酮/橄欖油(AOO)(4∶1 v/v)配制而成，2,4-二硝基氯苯(DNCB)(中國醫藥總公司北京分公司)與異丙醇(IPA，北京化工廠)分別用AOO配成0.1% (w/v)、0.3% (w/v)、1.0% (w/v) 和25%(v/v)、50%(v/v)、100%(v/v)3個濃度；丁子香酚(EUG)與己基肉桂醛(HCA)均購自Sigma公司，均用AOO配成25%(v/v)、50%(v/v)2個濃度；3種化妝品原液直接涂抹于小鼠耳背皮膚。

1.2實驗動物

SPF級BALB/c和CBA小鼠，雌性，8～10周齡，分別由中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源中心和北京華阜康生物科技股份有限公司提供，合格證號分別為【SCXK(京)2009-0017】、【SCXK(京)2009-0004】。動物試驗環境為中國食品藥品檢定研究院屏障系統動物房【SYXK(京)2011-0008】，溫度(22±2)℃，濕度50%～70%，動物自由飲食，12 h人工照明。

1.3試劑和儀器

BrdU粉劑與BrdU-ELISA試劑盒均購自德國Roche公司(編號10280879001、11647229001)。BrdU標記液用生理鹽水配制成10 mg/mL。SYNERGY HT型全自動酶標儀(美國BIO TEK 公司)、CR22G III型低溫離心機(日本HitacHi公司)。

1.4方法

1.4.1動物分組和染毒[4, 11]

動物隨機分為4只/組，4種化學物(己基肉桂醛、丁子香酚、2,4-二硝基氯苯、異丙醇)分別設為2～3個不同劑量組，共用一個AOO溶劑對照組；3種化妝品(1號精華霜、2號防曬霜、3號燙發劑)分別設一個最高劑量組，共用一個蒸餾水對照組。將受試物25 μL/耳/d涂抹于小鼠雙耳背部皮膚，連續涂抹3 d，對照組涂抹AOO或蒸餾水，第4天不處理，第5天腹腔注射BrdU標記液0.5 mL，第6天處死動物分離頜下淋巴結。

1.4.2淋巴細胞制備[4, 11]

BrdU標記液腹腔注射后24 h，處死動物，摘取頜下淋巴結，研磨后用不銹鋼篩網(200目)過濾制成單細胞懸液，PBS洗2次(離心1200 r/min，8 min)，每只小鼠的淋巴細胞定容于14 mL PBS中。

1.4.3ELISA檢測細胞增殖

將細胞懸液100 μL /孔加至96孔板中，離心(1400 r/min，10 min)，棄上清，吹干細胞。經ELISA試劑盒處理后用酶標儀檢測Brdu值(發射波長和參考波長分別為370 nm，492 nm)，BrdU標記指數為(A370-A空白370)-(A492-A空白492)。

1.4.4SI、EC1.6值計算與致敏性分級

刺激指數( stimulation index，SI)=受試物組BrdU標記指數均值/溶劑對照組BrdU標記指數均值；SI≥1.6，并有劑量-效應關系，該受試物為致敏陽性[4, 11]。根據SI計算EC1.6值和致敏級別，計算公式為[11]：①EC1.6=c+[(1.6-d)/(b-d)]×(a-c)(受試物各濃度組對應SI值包括>1.6和<1.6)，②EC1.6=2^{log2(c)+[(1.6-d)/(b-d)]×[log2(a)-log2(c)]}(受試物各濃度組對應SI值均>1.6)，其中設a、c為鄰近兩點受試物的濃度，b、d為對應的SI值；當SI=1.6時，其對應的受試物濃度即為EC1.6值。分級標準為：EC1.6%<0.1極強，0.1≤EC1.6%<1.0強，1.0≤EC1.6%<10中,10≤EC1.6%<100弱[11]。

2結果

2.1染毒期間動物狀態觀察

染毒期間動物正常飲食，體重增長良好。部分組別(1% 2,4-二硝基氯苯)小鼠染毒部位出現水腫、紅斑或結痂刺激性或致敏性癥狀，各臟器未見有任何病變，未觀察到明顯的其他毒性癥狀。

2.2兩品系小鼠BrdU標記指數和刺激指數SI值比較

由表1可見，BALB/c和CBA小鼠：AOO和蒸餾水對照組的BrdU標記指數較一致，淋巴結增生程度均較低；3種已知致敏物(2,4-二硝基氯苯，丁子香酚和己基肉桂醛)各濃度SI均大于1.6，且均有明顯的劑量-反應關系；非致敏物異丙醇各濃度SI均小于1.6，與有關文獻報道一致[11]。1、2號化妝品SI均小于1.6，判斷為無致敏性，3號染發劑SI大于1.6，為致敏陽性。

表1　兩品系小鼠對4種化學物和3種化妝品LLNA:BrdU-ELISA測定結果

注：VS: 極強；M：中。

Note: VS: very strong; M: moderate.

2.3兩品系小鼠EC1.6值與致敏性分級比較

兩品系小鼠：2,4-二硝基氯苯EC1.6值較相近，為極強致敏物；丁子香酚和己基肉桂醛EC1.6值不是很一致，但均在1～10范圍內，為中等強度致敏物(表1)。

3討論

由于實驗動物的種屬、性別、年齡等差異影響實驗結果，因此選擇合適的實驗動物進行相關實驗尤為重要。OECD指南(TG429、TG442)推薦使用CBA雌性小鼠，給國內各毒理實驗室推廣該LLNA方法帶來了困難。BALB/c小鼠是國內應用較多的近交系，遺傳背景明確、穩定，國內外已有學者將BALB/c小鼠應用于LLNA研究[5-10]，但目前國內外關于該兩品系小鼠LLNA:BrdU-ELISA法評價化學物和化妝品致敏性的比較研究還未見相關報道。

本研究將BALB/c和CBA小鼠分別對不同致敏強度的4種化學物和3種化妝品進行評價，結果兩品系對AOO和蒸餾水溶劑對照反應均較低，對2,4-二硝基氯苯、丁子香酚和己基肉桂醛和3號燙發劑反應均呈致敏陽性(SI>1.6)，且3種化學物劑量-反應關系顯著；對異丙醇和1、2號化妝品反應均呈致敏陰性(SI<1.6)。

從表1中我們可以發現CBA小鼠BrdU標記指數和刺激指數SI值均偏高于BALB/c，推斷CBA小鼠較BALB/c表現出更高程度地BrdU攝取，但兩品系對4種化學物和3種化妝品的致敏性判斷一致，雖然2,4-二硝基氯苯、丁子香酚和己基肉桂醛的EC1.6值存在差異，但致敏強度分級均一致，表明該兩品系小鼠只是反應程度有一定的差異，對化學物和化妝品致敏性判斷及致敏強度分級并無顯著影響。國際上也有學者將不同品系小鼠進行了LLNA研究[5-6,12]，其結果與本研究一致。

綜上，BALB/c和CBA小鼠LLNA: BrdU-ELISA試驗結果較一致，均可較好地評價化學物和化妝品的致敏性，BALB/c小鼠可替代CBA在國內各毒理實驗室推廣應用于化妝品皮膚致敏性評價。

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〔修回日期〕2015-03-31

技術方法

The comparative study of two strains on results of Local lymph node assays

HU Pei-li，ZHANG Lu-yong，LI Bo，XING Shu-xia

(National Institutes for food and drug control，Beijing 100050，China)

【Abstract】ObjectiveTo analyze and compare results of local lymph node assays (LLNA) between BALB/c and CBA mice. Methods 4 chemicals (2,4-dinitrochlorobenzene, eugenol, hexyl cinnamic aldehyde and isopropanol) and 3 cosmetics were applied to the dorsum of both ears of Balb/c and CBA mice for three consecutive days. BrdU solution was injected inter-peritoneally on day 5. On day 6, the bilateral draining auricular lymph nodes were excised and made into single cell suspension, the lymph cell proliferation was measured by BrdU ELISA kit. Results2,4-dinitrochlorobenzene, eugenol, hexyl cinnamic aldehyde and NO.3 perm agent pretended positive for both strains, EC1.6 values of three chemicals were found to be 0.08% (very strong), 4.02% (moderate), 6.68% (moderate) and 0.07% (very strong), 6.08% (moderate), 8.89% (moderate) for BALB/c and CBA mice respectively. Isopropanol, NO.1 and NO.2 cosmetics pretended to be non-sensitizers with SI<1.6 for both strains. Conclusion This study showed that BALB/c mouse was essentially equal to CBA for LLNA: BrdU-ELISA, which suggested that BALB/c mouse was a good alternative for CBA used in chemicals and cosmetics allergenic evaluation.

【Key words】Local lymph node assay；Strain；Cosmetics

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.013

【中圖分類號】R758.22R332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 05-0054-04

[作者簡介]胡培麗(1981-)，女，碩士，助理研究員，研究方向：食品化妝品安全性評價，E-mail： hupeili-1981@163.com。

[基金項目]中檢院中青年基金項目(2013NC3)。