健脾散結方對Lewis肺癌小鼠細胞相關凋亡蛋白及端粒酶活性的影響

譚國柱　王秀娟

(萊蕪市人民醫院腫瘤科，山東　萊蕪　271100)

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健脾散結方對Lewis肺癌小鼠細胞相關凋亡蛋白及端粒酶活性的影響

譚國柱王秀娟

(萊蕪市人民醫院腫瘤科，山東萊蕪271100)

摘要〔〕目的觀察健脾散結方對Lewis肺癌小鼠細胞相關凋亡蛋白及端粒酶活性的影響。方法選用C57BL/6小鼠接種Lewis肺癌細胞建立動物模型，按實驗分組分別干預21 d，觀察腫瘤生長情況，采用SABC免疫組化法檢測Survivin、c-myc表達，PCR-ELISA法檢測端粒酶活性。結果健脾散結方組、順鉑組、聯合組的抑瘤率分別為42.36%、57.38%、69.71%；與模型組比較，各藥組均可降低Survivin 與c-myc 表達(P<0.05或P<0.01)，且聯合組最明顯，健脾散結方與順鉑有協同作用；各藥組端粒酶活性均低于模型組(P<0.05)，且健脾散結方組、順鉑組與聯合組比較均有顯著差異(P<0.05)。結論健脾散結方抑制腫瘤作用可能與下調Survivin、c-myc表達，誘導細胞凋亡，抑制端粒酶活性有關。

關鍵詞〔〕健脾散結方；肺癌；細胞凋亡；端粒酶

第一作者：譚國柱(1965-)，男，副主任醫師，主要從事腫瘤研究。

肺癌在臨床惡性腫瘤中最為常見，其發病率與死亡率逐年上升，防治形勢十分嚴峻，中西醫結合治療是肺癌多學科治療的重要手段之一，辨證論治、遣方用藥無不體現出獨特的優勢〔1〕。健脾散結方是我科長期臨床實踐總結出的有效方藥，從脾著手，培土生金，治療肺癌取得了較好療效。因此，本研究探討健脾散結方對Lewis 肺癌小鼠細胞相關凋亡蛋白及端粒酶活性的影響及其相關機制。

1材料與方法

1.1實驗動物與瘤株C57BL/6小鼠60只，雄性，體重(200±20)g；Lewis 肺癌細胞株，均購于中國醫學科學院。

1.2主要藥物試劑與儀器藥物：健脾散結方由黃芪，黨參，陳皮，半夏，莪術，全蝎，蜈蚣，白花蛇舌草組成，水煎制成湯劑，濃縮至生藥1 g/ml，4℃保存備用；注射用順鉑(齊魯制藥有限公司)。試劑：SABC免疫組化試劑盒、Survivin、c-myc一抗、抗原修復液(均為武漢博士德生物有限公司)，端粒酶PCR-ELISA試劑盒(Roche公司)。儀器：高速冷凍離心機、微量高速離心機(上海醫學儀器廠)，多功能顯微鏡、石蠟包埋機、組織切片機、全封閉自動脫水機(均為德國Leica 公司)，HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(武漢同濟醫科大學千屏影像工程公司)，酶標儀(美國Thermo公司)。

1.3動物模型建立與分組將Lewis肺癌細胞株分別接種于10只C57BL/6小鼠右側腋下，待小鼠右腋部皮下瘤體隆起明顯時于無菌條件下取出瘤體，研磨，稀釋，制備細胞懸液，調整細胞濃度至1×107/L，每只0.2 ml接種于50只C57BL/6小鼠右側腋窩皮下，復制Lewis 肺癌小鼠模型，造模成功后選取40只隨機分為模型組、健脾散結方組、順鉑組、聯合組(順鉑+健脾散結方)四組，每組10只；四組分別給予生理鹽水、健脾散結方制劑、順鉑稀釋液、健脾散結方制劑+順鉑稀釋液0.2 ml/次灌胃，2次/d，共干預21 d，末次用藥后24 h內處死取材。

1.4腫瘤生長情況各組小鼠處死后稱取小鼠體重，完整剝取移植瘤體稱取其重量，計算抑瘤率，抑瘤率計算公式：抑瘤率=(模型組平均瘤重-各治療組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%。

1.5免疫組化檢測Survivin、c-myc表達組織固定，常規切片、脫蠟至水化，3%H2O2滅活內源性酶，熱修復抗原，5%BSA封閉液，一抗4℃過夜，二抗室溫20 min，SABC室溫20 min，DAB顯色，蘇木素輕度復染，脫水，透明，封片；顯微鏡觀察，胞質、胞核或胞膜為棕黃色顆粒為陽性表達，高清晰度彩色病理圖文分析系統分析。

1.6PCR-ELISA檢測端粒酶活性常規制備Lewis 肺癌小鼠細胞懸液，充分裂解，冰上孵育30 min，4℃離心20 min，取上清液；端粒酶擴增，ELLSA，酶標儀檢測，具體步驟參照試劑盒說明書逐步進行。端粒酶活性(RTA)=(AS1-AS0)/AS2/(TS1-TS0)/TS2〔2〕。

1.7統計學處理采用SPSS18.0軟件進行統計學分析，組間比較行單因素方差分析。

2結果

2.1腫瘤生長情況經實驗干預，各藥組瘤重明顯低于模型組(P均<0.05)，其中聯合組最低，與健脾散結方組及順鉑組比較均有顯著差異(P<0.01)。聯合組抑瘤率最高(P<0.05)。見表1。

組別瘤重(g)抑制率(%)模型組1.81±075-健脾散結方組1.16±0.641)3)42.363)順鉑組0.93±0.582)3)57.383)聯合組0.75±0.502)69.71

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與聯合組比較:3)P<0.05

圖1　各組Survivin、c-myc表達(DAB，×200)

2.2免疫組化檢測Survivin、c-myc表達各藥組Survivin表達均低于模型組(P均<0.05)，且健脾散結方組與順鉑組的表達均高于聯合組(P均<0.05)；各藥組c-myc表達均低于模型組(P<0.05)，聯合組低于健脾散結方組與順鉑組(P<0.05)。見表2，圖1。

組別Survivinc-myc模型組66.31±7.2459.73±9.82健脾散結方組56.34±5.491)4)51.64±7.601)4)順鉑組43.81±6.982)3)43.59±6.421)3)聯合組32.97±6.702)35.31±5.822)

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與聯合組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

2.3PCR-ELISA檢測端粒酶活性模型組、健脾散結方組、順鉑組及聯合組的端粒酶活性依次降低，分別為10.12±3.41、7.27±2.64、5.33±2.47、3.98±1.29。

3討論

中醫藥在肺癌治療中，具有提高生活質量、延長生存期的特點，其作用機制主要有抗血管生成、調節機體免疫、誘導腫瘤細胞凋亡、抗多藥耐藥及抑制端粒酶活性等方面〔4〕。細胞凋亡功能異常與腫瘤的發生發展密切相關〔5〕。近年來，隨著認識的深入發現與腫瘤細胞凋亡相關的基因、蛋白并不少，而Survivin、c-myc是其研究的熱點。Survivin屬凋亡抑制蛋白家族成員，是迄今為止發現的最強凋亡抑制因子，不但可直接或間接地抑制凋亡終末效應蛋白caspase的活化阻止細胞凋亡，還可與紡錘體纖維結合，保護細胞有絲分裂的完整性，抑制細胞的凋亡〔6〕。c-myc基因參與細胞增殖、分化和凋亡的調控，c-myc蛋白表達升高使細胞信號轉導和凋亡發生變化，導致細胞發生惡性轉變，是腫瘤發生發展的關鍵因子〔7〕。而端粒酶是一種能增加染色體末端5-TTAGGG-3 重復序列的核糖核蛋白酶復合物，其活性增高可引起細胞發生非正常凋亡，影響細胞壽命，與腫瘤細胞增殖平衡失調、凋亡密切相關〔8〕。

健脾散結方中黃芪、黨參具有健脾益氣之功，莪術、全蝎、蜈蚣具有散結消積之效，陳皮、半夏、白花蛇舌草可清熱解毒，方以黃芪為君，莪術為臣，余為佐藥，全方配伍精當，共奏健脾散結之效。且方中八味藥物在現代藥理研究中也表現出不同程度的抗腫瘤作用，例如莪術可誘導腫瘤細胞凋亡、影響腫瘤細胞分裂，具有廣譜的抗腫瘤活性〔9〕。結合肺癌患者臨床多見食欲差、厭食等脾胃癥狀，以及化療過程中的消化道反應等也同樣印證了健脾以培土生金在肺癌治療中的重要作用。研究結果提示健脾散結方與順鉑聯合有協同作用。說明健脾散結方可抑制凋亡蛋白Survivin、c-myc的表達，其可通過抑制腫瘤細胞的增殖分化誘導細胞凋亡而發揮抗腫瘤作用。隨著細胞分裂次數的增加，端粒可進行性縮短，縮短到一定程度則會失去分裂增殖能力〔10〕，提示端粒酶活性越強，抗凋亡作用越明顯，而健脾散結方可抑制端粒酶活性，從另一層面說明其可通過影響端粒調節細胞生長，誘導腫瘤細胞凋亡。

參考文獻4

1李蓉，焦麗靜，許玲.非小細胞肺癌的中醫證型分布規律〔J〕.上海中醫藥雜志，2012；46(9)：95-7.

2Gilley D，Tanaka H.Telomere dysfunction in aging and cancer〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2005；37(4)：1000-6.

3陳華圣，許愛華，沈婷婷，等.六君祛痰解毒湯及其拆方對C57 BL/6J 小鼠Lewis 肺癌轉移的抑制作用〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2013；19(6)：249-53.

4沈麗萍，劉苓霜.中醫藥治療肺癌機制研究進展〔J〕.上海中醫藥雜志，2012；46(3)：85-8.

5李秀榮，李慧杰，王秀娟.六神丸對肺癌A549 細胞Caspase-3 及Survivin 表達的影響〔J〕.中醫學報，2013；28(4)：469-71.

6Blanc-brude OP，Mesri M，Wall NR，etal.Therapeutic targeting of the survivin pathway in cancer：initiation of mitochondrial apoptosis and suppression of tumor-associated angiogenesis 〔J〕.Clin Cancer Res，2003；9(7)：2683-9.

7Weng AP，Millholland JM，Yashiro-Ohtani Y，etal.C-myc is an important direct target of Notch1 in T-cell acute lymphoblastic leukemia/lymphoma〔J〕.Genes Dev，2006；20(15)：2096-102.

8陳曉峽，向小慶，葉紅.苦參堿及氧化苦參堿抗腫瘤作用的研究進展〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2013；19(11)：361-4.

9劉春英，王哲，郝宏黨，等.肺癌平誘導Lewis 肺癌小鼠腫瘤細胞凋亡的形態學研究〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2005;11(2)：46-8.

10盧宏達，孔慶志，雷章，等.端粒雙靶點抑制對肺癌細胞A549 衰老的影響〔J〕.腫瘤防治研究，2013；40(5)：434-5.

〔2014-09-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

通訊作者：王秀娟(1984-)，女，醫師，碩士，主要從事中西醫結合治療腫瘤的臨床與基礎研究。

中圖分類號〔〕R734〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6660-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.008