吡那地爾后處理大鼠缺血再灌注損傷心肌線粒體的蛋白質組學研究*

魏義勇，　李　科，　劉　云，　劉興奎，　王海英，　喻　田

(遵義醫學院附屬醫院麻醉科， 貴州 遵義 563003)

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吡那地爾后處理大鼠缺血再灌注損傷心肌線粒體的蛋白質組學研究*

魏義勇，李科，劉云，劉興奎，王海英，喻田△

(遵義醫學院附屬醫院麻醉科， 貴州 遵義 563003)

[摘要]目的： 運用蛋白質組學研究方法探討吡那地爾后處理對缺血再灌注損傷大鼠心肌的保護作用。方法: 建立Langendorff大鼠離體心臟缺血再灌注損傷模型，隨機分為吡那地爾后處理組(Pina組)和缺血再灌注損傷組(I/R組)，每組9只。提取心肌線粒體蛋白質行雙向凝膠電泳，應用質譜鑒定差異大于2倍的蛋白質點。結果: Pina組與I/R組比較，共發現7個差異蛋白質：Pina組NADH脫氫酶1α亞復合體10亞基(NDUFA10)﹑NADH脫氫酶鐵硫蛋白2(NDUFS2)和NADH脫氫酶黃素蛋白2(NDUFV2)表達低于I/R組；Pina組異檸檬酸脫氫酶α亞基(IDHA)和Δ3,5-Δ2,4-二烯酰輔酶A異構酶(ECH1)表達高于I/R組；另有2個蛋白質點均被鑒定為ATP合酶δ亞基，一個蛋白質點表達升高，而另一個表達降低。結論:吡那地爾后處理可能抑制了復合體Ⅰ的亞基(NDUFA10﹑NDUFS2和NDUFV2)代償性增加，但促進了IDHA和ECH1表達并引發了ATP合酶δ亞基發生磷酸化，這些改變可能均與吡那地爾后處理保護心肌的作用有關。

[關鍵詞]吡那地爾； 缺血再灌注損傷； 線粒體； 蛋白質組學； 后處理

吡那地爾(pinacidil，Pina)是一種非選擇性線粒體ATP敏感性鉀通道(mitoKATP)開放劑，其后處理能產生確切的心肌保護效應[1-2]。研究表明mitoKATP開放可能是后處理心肌保護作用機制的觸發點和終末效應器[3]，但具體機制仍不十分清楚。本研究擬通過分析吡那地爾后處理對缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷大鼠心肌線粒體蛋白質表達的影響，進一步探討吡那地爾后處理的心肌保護作用機制。

材料和方法

1材料

1.1動物選擇和分組健康雄性清潔級SD大鼠，體重250～300 g，4～5月齡[由第三軍醫大學提供，動物證書號為SCXK(渝)2007-0005]。將動物隨機分成2組：吡那地爾后處理組(Pina組)和缺血再灌注損傷組(I/R組)。

1.2主要試劑吡那地爾；Nycodenz密度梯度介質；灌注液為K-H液(mmol/L)：NaCl 118.00、KCl 4.75、CaCl22.50、NaHCO324.80、MgCl2·6H2O 1.19、KH2PO41.19和glucose 11.1;線粒體分離介質1×MS(210 mmol/L mannitol、70 mmol/L sucrose、5 mmol/L Tris-HCl和1 mmol/L EDTA，pH 7.4);裂解液(7 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、4% CHAPS、5 mmol/L EGTA和65 mmol/L DTT，pH 7.4)，以上試劑均購自Sigma。BCA蛋白濃度測定試劑盒由江蘇碧云天生物技術研究所提供，RCDC蛋白質定量試劑盒由Bio-Rad提供。

2方法

2.1建立模型腹腔注射異戊巴比妥鈉(40 mg/kg)后迅速沿劍突下打開胸腔，于主動脈根部剪下心臟，放入K-H液中，迅速將主動脈固定于Langendorff灌注管口，每組均灌注氧合的K-H液20 min，常溫下缺血40 min后，Pina組續灌初給予吡那地爾(50 μmol/L)2 min，續灌37 ℃含氧K-H液58 min,I/R組續灌37 ℃含氧K-H液60 min。參照文獻建立Langendorff離體大鼠心臟缺血再灌注損傷模型[4]，比較灌注20 min和續灌60 min時2組左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)及左室發展壓(left ventricular developed pressure，LVDP)的差異。

2.2線粒體蛋白質提取離體灌注后, 迅速取出心臟，浸入線粒體分離介質中冰浴勻漿。4 ℃ 1 500×g離心10 min，取上清液4 ℃ 15 000×g離心10 min，沉淀即為粗提線粒體。粗提線粒體加入Nycodenz密度梯度介質中，4 ℃ 100 000×g離心60 min,即得到純化線粒體。向純化線粒體中加入10倍體積的裂解液冰上孵育20 min, 超聲破碎3 min 后, 4 ℃ 20 000×g離心30 min，上清即為線粒體蛋白。Bio-Rad公司的RC DC試劑盒方法行蛋白定量檢測，350 μg分裝，-80 ℃保存。

2.3雙向凝膠電泳及質譜分析根據Bio-Rad公司的操作手冊優化雙向電泳過程，每組同時運行3個蛋白質樣品, 每個樣品重復3次。第一向等電聚焦電泳和第二向SDS-PAGE后，凝膠行硝酸銀染色。染色后的凝膠用EPSON Scan 2.2掃描儀透射掃描獲取圖像，PDQuest 8.0軟件分析比較2組間蛋白質點的差異, 表達量改變(上調或下調) 2倍以上認為有差異。切取差異蛋白質點膠粒行膠內酶解,運用MALDI-TOF-MS分析，獲得的肽質量指紋圖譜(PMF)通過Mascot軟件檢索蛋白質數據庫。同時, 對二級串聯質譜的肽序列信息進行檢索, 進一步確證鑒定結果，選取部分差異蛋白質用Western blot法行回復驗證。

3統計學處理

數據用均數±標準差(mean±SD)表示，使用SPSS 19.0軟件進行統計分析，采用t檢驗以及單因素方差分析進行組間差異比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1心功能的變化

灌注20 min，2組中LVEDP和LVDP均未發生明顯變化，續灌60 min，Pina組LVEDP低于I/R組(P<0.05)，而LVDP高于I/R組(P<0.05)，見表1。

表12組離體心臟左室心功能的變化

Table 1.The changes of left ventricular functions in the 2 groups (mmHg. Mean±SD.n=8)

GroupPerfusionfor20minReperfusionfor60minLVEDPLVDPLVEDPLVDPPina3.56±0.74122.40±8.707.87±1.21*87.66±6.21*I/R4.04±0.89115.70±6.8821.81±2.4756.81±7.40

*P<0.05vsI/R group.

2雙向凝膠電泳

經蛋白質點的檢測、背景扣除、量化和匹配后，每張凝膠上檢測出(480±22)個蛋白質點，PDQuest 8.0軟件分析后得到7個差異蛋白質點(圖1)，結果顯示，Pina組與I/R組比較，共發現7個差異蛋白質：Pina組NADH脫氫酶1α亞復合體10亞基(NDUFA10)﹑NADH脫氫酶鐵硫蛋白2(NDUFS2)和NADH脫氫酶黃素蛋白2(NDUFV2)表達低于I/R組；Pina組異檸檬酸脫氫酶α亞基(IDHA)和Δ3,5-Δ2,4-二烯酰輔酶A異構酶(ECH1)表達高于I/R組；另有2個蛋白質點均被鑒定為ATP合酶δ亞基，一個蛋白質點表達升高，而另一個表達降低。這些蛋白質點經MALDI-TOF-MS鑒定結果及豐度變化見圖2、表2。

Figure 1.The maps of two-dimensional electrophoresis in the 2 groups.

圖1Pina組與I/R組的凝膠圖像比較軟件分析后的差異蛋白質點

Figure 2.The changes of differential protein abundance in the 2 groups.

圖2Pina組與I/R組比較差異蛋白點的豐度變化

表2　2組差異蛋白質數據檢索結果

3回復驗證

Pina組NDUFA10和NDUFS2的表達均低于I/R組(P<0.05)，見圖3。此結果與雙向凝膠電泳的改變趨勢一致，證明本實驗結果可靠。

Figure 3.The expression of NDUFA10 and NDUFS2 proteins in each group detected by Western blotting. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsI/R group.

圖3NDUFA10和NDUFS2在各組表達的免疫印跡分析

討論

本研究證實吡那地爾后處理明顯改善了缺血鼠心功能，與既往的研究結果一致[4]。通過蛋白質組學研究方法比較了吡那地爾后處理與心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌線粒體蛋白質的表達圖譜，對7個差異蛋白質進行了鑒定，發現這些蛋白質均與能量代謝和線粒體呼吸鏈有關，具體分述如下。

本實驗發現Pina組復合體Ⅰ的亞基(NDUFA10﹑NDUFS2和NDUFV2)表達較I/R組低，推測可能是吡那地爾后處理的離體心臟，mitoKATP開放，K+進入線粒體內，激活線粒體NADH呼吸鏈，ROS生成減少，ATP生成增加[5]，H+-K+交換和H+-Na+交換加快，細胞內和線粒體內酸中毒改善，機體所需的代償減少，使得這3個蛋白質的表達增加程度降低。Kim等[6]通過兔心肌缺血預處理線粒體蛋白質組學研究發現，缺血預處理組NDUFA10和NDUFS2的表達較缺血再灌注損傷組低，并認為這種變化可能是作為代償措施來保護線粒體功能。有文獻報道NDUFS的亞基可能是治療心肌缺血再灌注損傷的靶點[7]，且NDUFV2可能是肥厚型心肌病損害的靶蛋白[8]。本實驗發現吡那地爾后處理導致復合體Ⅰ的3個亞基存在著相似的變化，而研究表明mitoKATP開放可能是預處理和后處理心肌保護作用的觸發點和終末效應器[2]，因此，這3個蛋白質的改變可能與mitoKATP開放心肌保護作用的機制有著緊密聯系。

IDHA和ECH1在線粒體呼吸鏈和能量代謝過程中起著重要作用，目前它們在心肌保護方面的文獻報道較少。本研究發現這2個蛋白質的表達在Pina組均高于I/R組，推測可能是吡那地爾后處理促進了它們的表達，以維持線粒體電子傳遞和能量代謝的正常功能。

研究表明，ATP合酶在預處理和mitoKATP開放心肌保護機制中均起著重要作用[9]。本研究發現有2個蛋白質點經鑒定均為ATP合酶d亞基，一個蛋白質點表達上調，而一個表達下調。推測可能是吡那地爾后處理致該蛋白質發生了磷酸化，且這種修飾在mitoKATP開放心肌保護作用機制中扮演著重要角色。學者通過腺苷和二氮嗪預處理心肌線粒體蛋白質組學研究發現ATP合酶的亞基發生了磷酸化，并證實ATP合酶的亞基磷酸化能起到心肌保護作用[10]。文獻顯示，ATP合酶的亞基發生磷酸化可能與mitoKATP開放的心肌保護作用機制有關[11-12]。

綜上所述，本研究證實吡那地爾后處理可能引起了復合體Ⅰ的亞基(NDUFA10﹑NDUFS2和NDUFV2)代償性增加程度降低，促進了IDHA和ECH1表達升高，引發了ATP合酶δ亞基發生磷酸化。這些改變可能均參與了吡那地爾后處理心肌保護作用的機制，且這幾個蛋白質極可能是mitoKATP開放心肌保護作用的關鍵蛋白質，對其深入研究有益于進一步揭示吡那地爾后處理的心肌保護作用機制。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81460462; No. 31460696；No. 31001128)；南昌大學研究生創新基金資助項目(No. cx2015170)

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81170177, No. 81030002)

·綜述·

Proteomic study of myocardial mitochondria with ischemia/reperfusion injury and pinacidil postconditioning in isolated rat heartsWEI Yi-yong, LI Ke, LIU Yun, LIU Xing-kui, WANG Hai-ying, YU Tian

(DepartmentofAnesthesiology,TheAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China.E-mail:zyyutian@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the protective effect of pinacidil postconditioning on rat myocardium suffering ischemia/reperfusion injury by mitochondrial proteomics. METHODS: Langendorff apparatus was used to establish the model of myocardial ischemia/reperfusion injury. Sprague-Dawley rats were randomly divided into 2 groups: pinacidil postconditioning group (Pina group) and ischemia/reperfusion injury group (I/R group). After 20 min of perfusion with K-H solution, the perfusion was suspended for 40-min (global ischemia) follow by 60 min of reperfusion in I/R group. In Pina group at the end of 40 min global ischemia, the isolated hearts were perfused with K-H solution containing pinacidil (50 μmol/L) for 2 min followed 58-min perfusion with regular K-H solution. Total proteins extracted from the mitochondria were applied to the two-dimensional gel electrophoresis (2-DE). The differentially expressed protein spots over 2 times were evaluated by a software. Then they were subjected to in-gel digestion, and analyzed by spectrometry. RESULTS: The expression levels of NDUFA10, NDUFS2 and NDUFV2 were elevated but those of IDHA and ECH1 were decreased in Pina group compared with I/R group. Interestingly, 2 spots in the 2-DE map were identified as ATPase subunit δ. The expression levels of one spot was elevated, while the other was decreased. CONCLUSION: Pinacidil postconditioning may decrease the degree of increased expression levels of NDUFA10, NDUFS2 and NDUFV2, promote the expression of IDHA and ECH1, and induce the phosphorylation of ATPase subunit δ, which may be related to the protective mechanism of pinacidil postconditioning.

[KEY WORDS]Pinacidil; Ischemia/reperfusion injury; Mitochondria; Proteomics; Postconditioning

通訊作者△余瓊芳 Tel： 0791-86259017； E-mail： qiongfangyu@yeah.net； 高典 Tel： 0791-86360556; E-mail： gaodian@ncu.edu.cn △Tel: 010-66936762; E-mail: liyangbsh@163.com

[收稿日期]2015- 09- 18[修回日期] 2015- 10- 14 2015- 07- 07[修回日期] 2015- 10- 13

[文章編號]1000- 4718(2015)12- 2296- 05

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.030

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A