ZFN,TALEN,CRISPR/Cas9和NgAgo/gDNA四代基因編輯系統及其在農業和林業上的應用展望

趙華東漯河醫學高等專科學校

ZFN,TALEN,CRISPR/Cas9和NgAgo/gDNA四代基因編輯系統及其在農業和林業上的應用展望

趙華東
漯河醫學高等?？茖W校

基因編輯技術是當前生命科學和醫學的科學前沿，本文力求用最淺顯語言講述基因編輯技術及四代[1-4]基因編輯系統。文后列舉課題，以咨參考。

基因編輯；技術

在今年的5月2日，科學家韓春雨與合作者在《自然·生物技術》發表的一篇論文[5]，標志著一種名為NgAgo-gDNA的基因編輯系統的誕生。有人稱NgAgo-gDNA系統為第四代基因編輯系統。接下來我們就看一看四代基因編輯系統的來龍去脈。

1 從分子水平上改變生物體性狀的技術

生命體的形態結構和生理特征，如ABO血型，都稱為性狀。性狀都是由基因決定的，基因的成分就是DNA。我們編輯基因就能改變生物體外在的性狀，這就是基因編輯。通過基因組編輯技術能實現三種目的：基因敲除、特異突變和定點轉基因。

2 所有基因編輯系統的一般作用模式

不論是第一代鋅指核酸內切酶（ZFN）系統[1]和第二代類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）系統[2]，還是第三代CRⅠSPR∕Cas9系統[3,4]，還有被稱為第四代的NgAgo-gDNA系統[5]都有相通的一般作用模式：

（1）這些系統都有一個特異性“抓手”，用以識別和抓住目標基因的特異性DNA序列：①ZFN系統的抓手由鋅指蛋白充當；②TALEN系統的抓手是激活因子樣效應物；③對于CRⅠSPR∕Cas9系統來說，抓手是一段單鏈RNA序列；④NgAgo-gDNA系統的抓手是一段5’端磷酸化的單鏈DNA。

（2）這些系統都有剪切DNA的“剪刀”：①第一代的剪刀是非特異性核酸內切酶；②第二代的剪刀是切斷DNA雙鏈的核酸酶；③第三代的剪刀是Cas9；④而NgAgo-gDNA系統的剪刀是NgAgo，適合在人體細胞中進行基因組編輯。

（3）目標的達成都依賴生物體的DNA損傷修復的應答機制。

3 四代基因編輯系統的比較

第一代ZFN系統[1]，技術上較難，①需高投入設計ZFN；②過量ZFN對細胞有損傷；③精確程度和后果較難預料；④ZFN的脫靶切割會導致細胞毒性，在基因治療的領域出現了應用局限。

第二代TALEN系統[2]，技術上較易，①可設計性強，不受上下游序列影響；②與基因組的特異性結合受鄰近序列的影響；③仍有一定細胞毒性，模塊組裝過程繁瑣。

第三代CRⅠSPR∕Cas9系統[3,4]，技術上容易，①天然存在的系統，識別的精度高；②更為簡單和廉價，具有效率性和簡易性；③降低了脫靶幾率，減低了細胞毒性；④Cas9基因組的靶點選擇受到PAM區和富含GC區的限制；⑤RNA易于形成復雜的二級結構而帶來的失效或者脫靶效應。

第四代NgAgo-gDNA系統[5]，較之以前更為先進，技術優勢明顯，①向導設計制作簡便，無需構建表達載體；②對基因組任何位置都能有效引入雙鏈斷裂；③由于向導核酸是DNA，大幅降低了失效和脫靶率，對游離于細胞核的DNA具有更高的切割效率；④NgAgo結合24個堿基的gDNA，這比Cas9的gRNA19個堿基要長5個堿基，理論上其精確性要提高1024倍；⑤已經證實NgAgogDNA能夠對哺乳動物基因組進行高效地編輯；⑥可用于微生物、植物和動物的精準基因改造，在多方面具有重要應用價值。

4 基因編輯在農業和林業上亟待解決的重大課題舉例

例1：有“行道樹之王”之稱的喬木——懸鈴木，極大地改善了城市的生態環境，是一種非常優良的綠化樹種。但是懸鈴木有兩個比較突出的缺點——其一是球果飛絮，其二是花粉過敏，這些幾乎成了城市公害[6,7,8]。如果篩選出產生球果的關鍵基因，用基因編輯技術給予基因敲除，培育出不產生球果和花粉的懸鈴木，就能夠極大地造福社會。

例2：楊樹給人們帶了可觀的經濟效益和環境效益。但是楊樹一個很大的缺點[9,10]——產生了大量的楊絮，污染空氣，造成了糧食減產、樹木生長遲緩。圍繞著楊絮治理的種種辦法，效果卻不令人滿意。如果我們能從楊樹的基因組中篩選出楊樹開花的關鍵性基因，用基因編輯技術給予敲除，培育出不產生楊絮的品種，就能夠一勞永逸地解決這個困擾性的問題。因此可以說，基因編輯技術在農業和林業上具有廣泛的應用前景。

[1]Bibikova M,et al.Targeted chromosomal[J].Genetics,2002, 161(3):1169-75.

[2]Hockemeyer,Det al.Genetic engineering[J].Nature Biotechnology,2011,29(8):731-4.

[3]Jinek M,et al.A Programmable[J].Science,2012,337(6096): 816-21.

[4]Cong L,et al.Multiplex genome engineering using CRⅠSPR∕Cas systems[J].Science,2013,339(6121):819-23.

[5]Gao F,et al.DNA-guided[J].Nature biotechnology,2016.

[6]唐曉嵐等.南京2種常見行道樹致敏性及其控制措施[J].吉首大學學報:自然科學版,2014,35(3):69-73.

[7]劉健.怎樣使二球懸鈴木果絮不污染環境[J].中國花卉盆景, 2007(12):33-33.

[8]王愛霞,方炎明.二球懸鈴木不同器官對空氣中Cu、Ni、Pb和Zn的累積作用[J].植物資源與環境學報,2015(2):67-72.

[9]李萍.皖北楊絮的危害及防控[J].農業災害研究,2014(11): 18-19.

[10]程心杰.楊絮的危害及解決措施[J].現代農業科技,2014 (16):155-156.