肝纖維化的血清標志物篩查

邢文斌 劉威 朱承美

肝纖維化的血清標志物篩查

邢文斌 劉威 朱承美

目的探討與發現肝纖維化的血清標志物。方法采用高效液相色譜-軌道離子阱質譜聯用質譜(UPLC/LTQ-Orbitrap MS)技術來分離并提取慢性乙型肝炎(14例)、代償期肝硬化(20例)、失代償期肝硬化(15例)患者及健康志愿者(20例)血清中的代謝產物。結果健康對照組、慢性乙型肝炎組、肝硬化代償期組、肝硬化失代償期組代謝產物分布存在很大的差異,其中差異最大的代謝產物為羧乙基精氨酸、 輔酶Q1和甘氨脫氧膽酸,并隨著肝纖維化程度的加重而增加。結論羧乙基精氨酸、輔酶Q1及甘氨脫氧膽酸三種代謝產物可以作為肝纖維化的血清標志物。

肝纖維化；血清標志物

長期的慢性乙型肝炎病毒感染可以導致肝臟不同程度的肝纖維化甚至肝硬化,但肝纖維化的進展十分隱匿,很多臨床診斷為慢性乙型肝炎的患者其肝活檢組織學已為肝硬化,甚至許多慢性乙型肝炎病毒感染者一旦確診即為肝硬化,早期發現和診斷肝硬化對改善患者預后十分必要。本實驗采用高效液相色譜-軌道離子阱質譜聯用質譜(UPLC/LTQOrbitrap MS)技術來分離并提取慢性乙型肝炎、代償期肝硬化以及失代償期肝硬化患者血清中的代謝產物,以期發現肝纖維化的代謝產物標志物群。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選取2011年10月～2013年9月于煙臺市傳染病醫院就診的慢性乙型肝炎患者34例,所有患者均接受了肝穿刺病理檢查,隨機選取于大連市第六人民醫院住院治療的失代償期肝硬化患者15例。同期選擇20例健康志愿者作為健康對照組,肝功正常、病原學檢查陰性。所有入組人員在知情同意的前提下,留取空腹血4ml,30min內將血清分離,留取血清,-80℃冰箱冷凍保存備檢。

1.2 方法 高效液相色譜-軌道離子阱質譜聯用質譜(UPLC/LTQ-Orbitrap MS)技術檢測所有受檢者血清中的代謝產物。

1.2.1 樣品準備 室溫下靜置解凍血清,取100 μl血清加400 μl甲醇除蛋白,渦旋60 s,13000 rpm離心15min,取上清液400 μl置冷凍濃縮儀凍干。

1.2.2 超高效液相色譜分析 采用超高效液相色譜分析儀。沖洗柱采用10.0cm×2.1 mm×1.7 μm C18柱根據梯度不同而改變的乙腈溶液沖洗,根據物質在柱內停留時間的長短,完成各種代謝產物的分離。

1.2.3 高效液相色譜-軌道離子阱質譜聯用質譜(UPLC/ LTQ-Orbitrap MS) 通過采用LTQ-Orbitrap質譜分析儀,對已經分離的代謝產物實行ESI+模式操作。

1.3 確定代謝產物名稱 根據精確分子量來分析、研究確定代謝產物名稱。

1.4 統計學方法 采用SPSS18.0統計學軟件處理數據。通過Micromass Marker Lynx獲取每峰停留時間(tr)和m/z數據對,標準化輸出每峰離子密度后,進行主成分分析(PCA)；根據非參數檢驗結果,尋找差異比較大的代謝產物。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 本實驗對臨床診斷為慢性乙型肝炎的34例患者進行了超聲引導下肝臟穿刺術的組織病理學診斷結果發現,S1期8例,S2期5例,S3期1例,S4期20例。其中慢性乙型肝炎(即組織學分期為S1～S3期)有14例,代償期肝硬化有20例(即組織學分期為S4期)。

2.2 在SIMCA-P軟件中采用自動匹配的方法處理質譜原始數據,建立了PCA模型(見圖1)。從模型圖中可以看出,健康對照組、慢性乙型肝炎組、肝硬化代償期組、肝硬化失代償期組代謝產物分布存在很大的差異,質量控制組(QC)聚合均良好,說明實驗較為穩定。

2.3 在PCA的基礎上進行空間坐標軸旋轉,以消除組內變異對組間分類的負面影響,使組間的差異最大化,建立PLSDA模型(見圖2)。圖中顯示健康對照組、慢性乙型肝炎組、肝硬化代償期組、肝硬化失代償期組有較為明顯的分開趨勢。

2.4 潛在標記物的篩選,對49個患者樣本和20個健康志愿者樣本做非參數檢驗,得到483個特征離子碎片,定性出40個差異物質。RSD<20%。對患者組和健康組得到的40個特征離子做ROC曲線。擬合較好,得到三種代謝物：羧乙基精氨酸(octopine)、 輔酶Q1(coenzyme Q1)、甘氨脫氧膽酸(GDCA)。

3 討論

長期的慢性乙型肝炎病毒感染可以導致肝臟不同程度的肝纖維化甚至肝硬化,實驗中對34例慢性乙型肝炎患者進行肝組織活檢,結果發現,S1～S3期14例,S4期20例。即慢性乙型肝炎(即組織學分期為S1～S3期)有14例；代償期肝硬化有20例(即組織學分期為S4期),占59%,這與在選擇肝穿患者時更傾向于早期肝硬化的患者有關。如此可見,臨床診斷為慢性乙型肝炎的患者中確實部分存在組織學已達到肝硬化(組織學分期為S4期)診斷的患者,探索和發現肝纖維化的血清標志物是十分必要的。

本實驗采用高效液相色譜-軌道離子阱質譜聯用質譜(UPLC/LTQ-Orbitrap MS)技術對慢性乙型肝炎、代償期肝硬化、失代償期肝硬化三組患者的血清中的代謝物進行檢測,建立了PCA和PLS-DA模型,結果找到三種代謝產物,分別是：羧乙基精氨酸、 輔酶Q1、甘氨脫氧膽酸。

精氨酸刺激溶解性鳥苷酸環化酶,降低鈣離子濃度,促進NO以自泌的方式調節肝內阻力,使血管舒張,肝臟星形細胞(HSC)松弛,促使肝竇內皮細胞會降低NO的釋放,使血管緊張劑與血管舒張劑失衡,導致肝纖維化的形成。輔酶Q是一種脂溶性醌類化合物,能在線粒體膜中迅速擴散,極易從線粒體膜中分離出來。甘氨脫氧膽酸鹽(GCDC)屬于疏水性膽汁酸,國內外大量的研究表明,疏水性膽汁酸如甘氨脫氧膽酸、脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸等對原代培養的大鼠肝細胞有明顯的凋亡作用［1-3］。膽汁酸通過死亡受體通路和線粒體通路介導可直接激活促進肝細胞調亡的Fas受體及Bax,可使線粒體膜通透性增加,細胞腫脹、溶酶體破壞,釋放蛋白酶、細胞因子等有毒物質激發炎癥反應,對機體造成損壞,具有較大的細胞毒作用。GCDC可通過影響HL-7702細胞跨膜轉導鈣離子,導致鈣超載和鈣穩態破壞,鈣離子濃度增加可以刺激PI3K/Akt,Rho激酶,核因子κ B(NF-κB)與MAPK通路,有促進纖維化的作用。甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)和甘氨膽酸(GCA)是共軛膽汁酸。高水平GCDCA和GCA出現在患者血清中表明患者發生嚴重的肝損傷。

羧乙基精氨酸、 輔酶Q1及甘氨脫氧膽酸三種代謝產物隨著肝纖維化程度的加重,呈明顯上升趨勢,說明與肝纖維化密切相關,可以作為肝纖維化的血清標志物,但三種代謝產物在體內濃度水平決定肝纖維化程度,有待于進一步研究。

［1］Ramm GA,Shepherd RW,Hoskins AC,et al.Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate andhepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cellrecruitment.Hepatology,2009,49(2):533-544.

［2］Higuchi H,Miyoshi H,Bronk SF,et al.Bid antisense attenuates bile acid-induced apoptosis and cholestatic liver injury.J Pharmacol Exp Ther,2001,299(3):866-873.

［3］Takikawa Y,Miyoshi H,Rust C,et al.The bile acid-activated phosphatidylinositol 3-kinase pathway inhibits Fas apoptosisupstream of bid in rodent hepatocytes.Gastroenterology,2001,120(7):1810-1817.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.23.038

2016-11-04］

116031 大連市第六人民醫院(邢文斌 劉威)；煙臺市傳染病醫院(朱承美)