RNA干擾的系統生物學研究進展

張 清，石張鎮，許 人，王世寶，姜 娜，王 晶，郭艷茹，孫延霞*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 腫瘤血液科，吉林 長春130033；2.吉林大學第一醫院二部 呼吸科)

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RNA干擾的系統生物學研究進展

張 清1，石張鎮1，許 人2，王世寶1，姜 娜1，王 晶1，郭艷茹1，孫延霞1*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 腫瘤血液科，吉林 長春130033；2.吉林大學第一醫院二部 呼吸科)

RNA干擾(RNAi)，又名RNA沉默，是指由雙鏈DNA(dsRNA)引起的特異性基因抑制現象。目前，RNAi已經成為了一種非常強大的實驗方法，用于大規模的基礎和臨床研究。雖然體外RNAi效果很好，但它在應用于體內仍有挑戰性，這也是臨床應用RNAi技術的難點。系統生物學是一個試圖整合不同層次信息以理解生物系統如何行使功能的學術領域。RNAi的系統生物學研究內容主要包括：研究參與RNAi過程的組分，探索各不同組分之間的相互關系和相互作用，建立整個RNAi系統的可理解模型與仿真，用來指導合理的設計實驗和臨床上應用RNAi為基礎的治療。

RNAi的動力學研究是RNAi系統生物學研究的重要部分。對RNAi動力學的深入研究是臨床應用RNAi的基礎，尤其確定取得臨床療效所需的給藥方案將是成功應用RNAi的重要部分。目前研究體內RNAi需要高成本投入，全面探索RNAi的過程，正確理解影響RNAi的動力學參數，可以專門定制和優化用于科研與臨床的方案，從而節省大量的時間和資源。數學建模使用簡單的動力學方程反映RNAi過程中的每一步，可以揭示許多有關RNAi動力學方面的問題。部分研究者在這方面做了一些工作，也給我們帶來了更深的思考。以下就對于在研究RNAi系統生物學過程中的幾個關鍵問題進行分別闡述。

1 RNAi的機制

RNAi廣泛存在于真核細胞生物體中。1998年，美國科學家Fire和Mellow發現了RNAi的機制。細胞內異常的dsRNA被Dicer酶(RNaseIII家族中成員，負責識別并切割dsRNA)特異性識別并切割成長為21-23nt的短雙鏈RNA，稱為小干擾RNA(siRNA)；siRNA與細胞內的核酸內切酶、核酸外切酶、解旋酶等構成復合體，稱為RNA誘導的沉默復合體(RISC)，作用是對靶mRNA進行識別和切割。RISC的解旋酶將其中的siRNA變成單鏈，成為有活性的RISC，RISC與靶mRNA互補結合，利用自身核酸內切酶活性將mRNA切斷降解。siRNA不僅能引導RISC切割同源單鏈mRNA，RISC中的siRNA與靶mRNA結合時還可以作為引物，在RNA聚合酶(RdRp)的作用下，合成更多新的dsRNA。RNAi的核心途徑可以簡單概括為起始、效應、放大三個階段。

除了siRNA，微小RNA(miRNA)也是基因表達的轉錄

后調控因子。miRNA是生物體中普遍存在的內源性的具有發夾結構的單鏈轉錄產物，它通過RNAi機制發揮生物學作用，靶向抑制mRNA翻譯[1]，從而參與真核生物的幾乎所有基因的表達調控。一些研究表明，外源導入的siRNA能使體內和體外細胞的RNAi途徑飽和，導致參與競爭的siRNAs的效果下降，而增加他們的靶基因的表達水平。而siRNAs使RNAi途徑飽和的同時，也能導致內源性miRNA的功能失調[2，3]。即，外源引入的siRNA與內源性miRNA這兩種小RNAs都與RNAi途徑相關。

2 RNAi的動力學及建模

起始階段，dsRNA被dicer酶剪切成siRNA。有實驗[4-6]表明dsRNA的初始劑量越大產生的沉默效應越顯著。也就是說，RNAi反應程度是受dsRNA初始劑量大小的影響。2005年，Groenenboom MA等人[7]對核心途徑建立了三個擴展模型對RNAi的劑量依賴性做出了系統生物學闡述。其中“RNase模型”說明了特異性核糖核酸酶(RNase)降解siRNA涉及的飽和動力學，即劑量依賴是由于siRNA降解酶的飽和引起。通過模型證實了每個mRNA產生的dsRNA數是確定閾值的主要因素，即每個mRNA產生的dsRNA越多，觸發基因沉默的閾值越低。同理，增加RdRp合成dsRNA的速率也可以使相關模型的閾值降低。另外一些研究也表明了閾值的存在：Lipardi等人[8]發現在果蠅胚胎提取的dsRNA劑量低于閾值濃度不能誘發RNAi，而十倍劑量時便能夠觸發RNAi；Li等人[9]的結果也說明了在斑馬魚胚胎，小劑量的dsRNA只引起部分表型的改變，而高劑量的dsRNA引起超過50%部分表型和35%全部表型的改變。部分表型的效果可以表明胚胎體內只有短暫的反應，而高劑量的dsRNA觸發全部表型改變能夠表明有持續的反應。因此，RNAi的啟動依賴于dsRNA的初始劑量。另外，目前發現影響RNAi速率的生物成分還有Dicer酶[10，11]和Exportin-5[12]、dCRIF[13]等。

效應階段，siRNA參與形成RISC，RISC與靶mRNA結合并將靶mRNA降解。在轉染實驗中觀察到同時引入2個或更多人工siRNAs會使其中某種siRNA基因沉默活性減低[1,14-17]。因此RISC形成過程中小RNAs間的競爭是RNAi的重要限速因素。Loinger A等[18]提出了一個基于速率方程的精細模型，揭示了由于各種不同小RNAs之間的競爭引起的基因表達的整體變化。現已發現這主要是由于miRNA與外源性siRNA競爭Argonaute蛋白(Ago蛋白)引起，Ago蛋白是形成RISC的核心組件[19]，siRNA需裝載在Ago蛋白上才能引起基因沉默效應[20]。有研究發現真核生物細胞僅供應有限的幾種類型的Ago蛋白，比如人體細胞提供4種類型的Ago蛋白[11]，限制siRNA/miRNA參與組裝RISC的能力[16-17,21-24]。越來越多的證據表明，RISC的催化成分與Ago蛋白的相互作用，是RNAi途徑的關鍵限速步驟。Khan等[3]也應用系統生物學方法對小RNAs轉染實驗的數據進行統計分析，并通過構建線性消退模型，證實了細胞內RNAi的過程具有飽和效應，RNAi的沉默速率與這種飽和效應密切相關。

放大階段，以siRNA為引物、mRNA為模板在RdRp的作用下，合成更多的dsRNA。2003年，Bergstrom CT等人[25]提出了關于RNAi的單向放大模型，從RdRp的分子生物學角度說明在RdRp聚合作用下產生的dsRNAs與啟動沉默過程的dsRNAs不同。發生這種不同的原因是RNA聚合作用具有從5'到3'端的單向性，即合成dsRNA時，RdRp僅在引物片段的3'端方向操作，向引物片段上游延伸，上游的siRNAs在每一輪放大都增加，在連續一輪輪的放大之后，上游的siRNAs的不斷增多，而siRNA的分子數越來越小，直到siRNA分子數小至siRNA上游不能準備進一步的聚合，沉默反應最終消失。這一單向放大模型說明了沉默效應不能永久持續，單向放大確保沉默反應將僅在持續輸入dsRNA的情況下持續下去，即RNAi效應的持續需要dsRNA的濃度維持在某個特定范圍。而由于哺乳動物體內缺乏RdRp，他們只能被dsRNA誘導短暫的沉默[26]，而缺乏了放大階段，因此維持沉默效應只有通過不斷輸入dsRNA來完成。2006年，Derek W.Bartlett和Mark E.Davis[27]對哺乳動物體內RNAi動力學的研究是實用且具有代表性的。他們研究RNAi從siRNA遞送到細胞內起效的過程，研究主要對比了哺乳動物體內快速分裂細胞、慢分裂細胞與不分裂細胞中RNAi的效應程度和持續時間的影響因素，發現siRNA數量對基因沉默的作用大小有重大的影響，而對總持續時間影響較小；細胞倍增引起的稀釋效應造成分裂細胞的基因沉默持續時間縮短；不分裂細胞基因沉默的持續時間不受細胞分裂稀釋作用的控制，而是受來自細胞內siRNA內在的穩定的影響。這些結論在我們研究基因功能與基因治療中，能幫助我們分析和制定產生效應的siRNA閾值、效應持續時間、影響因素及變化特點等。

3 展望

綜上，盡管目前RNAi技術用于抑制基因的表達已相當成熟，但RNAi在用于基因治療上仍面臨很大的挑戰，不僅包括siRNA遞呈的載體和方式，更重要的內容是如何根據基因沉默的閾值、細胞增長率、siRNA穩定性等參數來指定給藥方案。盡管RNAi的系統生物學研究使我們對RNAi的機制有了更深的理解，但現階段我們還缺少大量的實驗來驗證我們設計的每一個模型是否真實有效，另外，已有模型尚不能模擬RNAi的全過程。隨著人們不斷的探索創新與完善，相信將來RNAi技術不僅在科研上而且在臨床上也能得到廣泛應用。

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吉林省自然科學基金項目(201215069)

1007-4287(2016)10-1783-03

2016-05-10)

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