二維高通量色譜分離制備海參來源真菌Epicoccum sp.的化學成分

齊君，夏雪奎，賈愛榮，劉新，張綿松，劉昌衡

(1.山東省科學院中日友好生物技術研究中心，山東省應用微生物重點實驗室，山東 濟南 250014；2. 山東省科學院生物研究所，山東 濟南 250014)

?

二維高通量色譜分離制備海參來源真菌Epicoccumsp.的化學成分

齊君1，夏雪奎1，賈愛榮2，劉新2，張綿松1，劉昌衡2

(1.山東省科學院中日友好生物技術研究中心，山東省應用微生物重點實驗室，山東 濟南 250014；2. 山東省科學院生物研究所，山東 濟南 250014)

摘要：建立了二維高通量色譜分離、純化海參來源真菌Epicoccum sp.中的海松烷二萜化合物的新方法。以甲醇-水為溶劑體系梯度洗脫，在流速為40 mL/min、主分離檢測波長為254 nm，二級分離檢測波長為220 nm的條件下進行分離，從1.5 g海參來源真菌Epicoccum sp.乙酸乙酯提取物中分離制備得到海松烷二萜化合物，通過核磁共振氫譜和質譜鑒定化合物的結構。該方法簡便、快捷且減少樣品的不可逆吸附，為海松烷二萜化合物的制備型分離提供了新手段。

關鍵詞：二維高通量分離制備色譜；海參來源真菌；海松烷二萜化合物

Separation and preparation of chemical components from sea

海參屬于海洋低等無脊椎動物中的棘皮動物，含有海參黏多糖、海參皂苷和多肽等活性成分，具有提高機體免疫力、抗衰老以及抗腫瘤等多種生理功能[1-3]。海參具有豐富的共附生微生物，其共附生真菌可以代謝結構新穎、活性多樣的次級代謝產物，近年來成為海洋活性天然產物研究的熱點之一[4-8]。最近，從海參真菌中已分離到了二萜、大環內酯和環己醇類似物等類型的化合物[9-11]，這些結構新穎的化合物多具有抗菌和細胞毒活性。其中海松烷二萜具有明顯的細胞毒活性[9]，是具有重要生物活性和藥用前景的海洋天然產物。

目前海洋微生物次級代謝產物的分離、純化方法主要是柱色譜法，如硅膠柱色譜、凝膠柱色譜和高效液相色譜等方法[12-13]，但這些方法存在耗時長、溶劑消耗大、容易造成樣品的不可逆吸附及樣品回收率低等缺點。對于活性次級代謝產物的制備，利用傳統分離方法，不能對其進行快速有效的分離。

二維高通量分離制備色譜技術是一種由高效液相色譜(HPLC)和固相萃取(SPE)精密串接的高通量分離制備色譜技術，適合復雜化合物的制備分離和純化。該技術經優化后，通過 HPLC / SPE / HPLC 全自動串接，可以將一個復雜樣品在 24 h內得到完全分離，耗時短，減少了溶劑消耗以及固定相對樣品的不可逆吸附。本研究采用二維高通量分離制備色譜技術從海參來源真菌Epicoccumsp.中分離獲得2個海松烷二萜化合物(結構式見圖1)，建立了一種快捷、簡單的海松烷二萜化合物制備方法，為海洋微生物次級代謝產物的分離和純化提供參考。

圖1　海松烷二萜化合物1和2的化學結構式Fig.1　Chemical structures of pimaranediterpenes1 and 2

1材料與實驗方法

1.1儀器與試劑

二維高通量分離制備色譜系統Sepbox 2D-2000，包括2個制備HPLC泵、1根進樣柱、1根主分離柱、3根二次分離柱、15根捕獲柱、1個紫外檢測器(力揚企業有限公司)；Waters 高效液相色譜系統(美國沃特世公司)；賽多利斯電子天平Balance BSA124S-CW(德國賽多利斯集團)。

菌株Epicoccumsp. 分離自煙臺芝罘島海域仿刺參，由上海生工生物工程技術服務有限公司測序。所得序列在 Genebank 中用 Blast 進行相似性分析，用Clustal 進行排列比較，確定該菌株為Epicoccumsp.。

用于制備海參來源真菌Epicoccumsp. 提取物的試劑為分析純乙酸乙酯；二維高通量分離制備色譜和高效液相色譜系統所用甲醇為色譜純(賽默飛世爾科技有限公司)，水為娃哈哈純凈水。

1.2海參來源真菌Epicoccumsp. 提取物的制備

1.2.1菌株的分離、發酵

將海參利用無菌水清洗 3 次，切成小塊(1 cm×0.5 cm)，-20 ℃速凍，打漿，在 PDA 培養基(80 mg/L，硫酸鏈霉素)涂布，28 ℃培養 20 d。該菌株保存于山東省科學院生物研究所食品生物技術研究室。利用液體培養基(土豆/海水0.2 g/mL，葡萄糖/海水0.02 g/mL)，室溫下搖床培養5 d，轉速170 r/min，制備種子培養基。利用大米固體培養基(大米/海水0.6 g/mL，121 ℃，20 min 高溫滅菌)培養15瓶，在室溫下靜置培養 28 d。

1.2.2乙酸乙酯提取物的制備

發酵28 d后，利用 3 倍體積的乙酸乙酯浸泡提取大米培養基發酵物，室溫下連續萃取 3 次，合并萃取液后減壓濃縮得到乙酸乙酯相浸膏 (1.5 g)。

1.3二維高通量色譜分離制備的過程

1.3.1樣品的分析

將真菌提取物用色譜甲醇溶解，0.45 μL微孔濾膜過濾，待用。應用Waters 高效液相色譜系統進行分析，色譜柱：YMC(250 × 10 mm)。流動相：A為水，B為甲醇。流速：0.8 mL/min。檢測波長：190～400 nm。柱溫：25 ℃。進樣量20 μL。按照以下梯度洗脫程序進行分析，洗脫程序：0～5 min，5%B；5～45 min，5%B～100%B；45～55 min，100%B；55～60 min，100%B～5%B。

1.3.2樣品的制備

打開二維高通量分離制備色譜系統Sepbox 2D-2000，用100%色譜甲醇以40 mL/min的流速沖洗整個系統，然后用100% 水以28～40 mL/min的梯度流速平衡系統，待平衡完畢打開紫外檢測器。

稱取1.5 g真菌提取物用有機溶劑溶解，然后與4.5 g C4反相硅膠混合拌樣，干燥后，裝入進樣柱，準備進樣。經分析后，應用儀器的原默認方法(表1)即可對樣品進行分離純化。主分離檢測波長為254 nm，二級分離檢測波長為220 nm。

2結果與討論

2.1樣品的分析

考察了真菌Epicoccumsp.乙酸乙酯提取物在不同波長(190～400 nm)下的色譜圖，在254 nm時，其HPLC色譜圖色譜峰較多、強度較高且分離度好，因此本研究選擇254 nm用于HPLC分析的檢測波長，見圖2。

圖2　樣品在檢測波長254 nm下的HPLC色譜圖Fig.2　HPLC chromatogram of crude extract of Epicoccum sp.in 254 nmdetection wavelength

2.2樣品的制備

根據樣品的分析結果，應用儀器的原默認方法即可對樣品進行分離純化。主分離檢測波長為254 nm。主分離洗脫條件如表1。樣品通過主分離，分別被15根捕獲柱捕獲，待二次分離。主分離結果見圖3。

表1　二維高通量分離制備色譜系統Sepbox 2D-2000的主分離洗脫條件

圖3　二維高通量分離制備色譜系統對樣品的主分離結果Fig.3　Main separation results of samples with two-dimensional high-throughput chromatography

接下來二維高通量分離制備色譜系統分別對15根捕獲柱中的樣品進行二級分離。二級分離檢測波長為220 nm。經過24 h的完全分離，結果得到化合物1和化合物2。兩個化合物的二級分離結果如圖4。

圖4　二維高通量分離制備色譜系統對樣品的二級分離結果Fig.4　Second-stage separation results of samples with two-dimensional high-throughput chromatography

2.3化合物結構鑒定

化合物1：無色晶體，熔點：195～200 ℃，IR (KBr) νmax3 395,2 926,1 701,1 628 cm-1; 1H (CDCl3, 600 MHz)δ: 6.98 (1H, s, H-14), 5.84 (1H, dd,J=17.4, 9.0 Hz, H-15), 5.05 (1H, d,J=10.2 Hz, H-16a), 5.10 (1H, d,J=10.2 Hz, H-16b), 4.18 (1H, dd,J= 9.6, 1.8 Hz, H-20a), 3.91 (1H, d,J= 9.6 Hz,H-20b),3.75 (1H, s, H-9), 2.50 (1H, dd,J=15.0, 1.8 Hz, H-1a), 2.28 (1H, d,J= 13.2 Hz, H-12a ), 2.25 (1H, d,J= 13.2 Hz, H-12b ), 1.56 (1H, m, H-3b), 1.51 (2H, m, H-2), 1.40 (3H, s, H-19), 1.32 (1H, ddd,J=13.8, 4.8, 4.8 Hz, H-1b), 1.24 (1H, m, H-3a), 1.24 (3H, s, H-18), 1.19 (3H, s, H-17)。HRTOFMS:m/z347.185 3 [M + H]+。以上數據和文獻報導的基本一致[9]，確定化合物1為Aspergilone A。

化合物2：無色晶體，熔點：197～218 ℃，IR (KBr) νmax3 418,2 927,1 703,1 624,1 392 cm-1; 1H (DMSO-d6, 600 MHz)δ: 6.81 (1H, s, H-14), 5.86 (1H, dd,J= 18.0, 10.2 Hz, H-15), 5.04 (2H, m, H-16), 4.05 (1H, m, H-11), 3.98 (1H, d,J=10.2 Hz, H-20b), 3.62 (1H,d,J=10.2 Hz, H-20a), 1.96 (1H, m, H-12b), 1.93 (1H, m, H-1b), 1.82 (1H, m, H-1a), 1.61 (1H, m, H-12a), 1.49 (1H, m, H-2b), 1.47 (1H, m, H-2a), 1.42 (1H, m, H-3b), 1.32 (3H, s, H-19), 1.17 (3H, s, H-17), 1.06 (3H, s, H-18), 1.00 (1H, m, H-3a)。HRESIMS:m/z387.178 9[M + H]+。以上數據和文獻報導的基本一致[14]，確定化合物2為Diaporthein B。

3結論

本研究運用二維高通量分離制備色譜技術從海參來源真菌Epicoccumsp. 的乙酸乙酯提取物中成功分離獲得2個海松烷二萜化合物。結果表明，與傳統分離技術相比，二維高通量分離制備色譜技術通過高效液相色譜和固相萃取有效結合，顯著提高了天然產物純化過程的速度，是分析、分離復雜組分物質的有效方法，能快速、高效地將微生物發酵液中的成分分離成純化合物。本研究不僅為海松烷二萜化合物的分離制備提供了一種新型、實用的方法，而且為海洋微生物次級代謝產物的分離純化提供了新的方法和思路。

參考文獻：

[1]閆冰，李玲，易楊華. 海參多糖的生物活性研究概況[J]. 藥學實踐雜志，2004，22(2)：101-103.

[2]ESMAT A Y, SAID A A, SOLIMAN A A, et al. Bioactive compounds,antioxidant potential, and hepatoprotective activity of sea cucumber (Holothuriaatra) against thioacetamide intoxication in rats [J]. Nutrition, 2013, 29(1): 258-267.

[3] 黃日明，王賓，劉永宏. 海參的化學成分及其生物活性的研究概況[J]. 中成藥，2009，31(8)：1263-1269.

[4] XIA X K, QI J, WEI F, et al. Isolation and characterization of a new benzofuran from the fungusAlternariasp. (HS-3) associated with a sea Cucumber[J]. Nat Prod Commun, 2011, 6(12): 1913-1914.

[5] 夏雪奎，齊君，劉昌衡，等. 仿刺參共附生真菌Aspergillusterreus來源的聚酮類化合物的研究[J]. 現代食品科技，2014，30(4): 10-14.

[6] 劉昌衡，夏雪奎，齊君，等. 海參共生微生物 HS-3Alternariasp. 次級代謝產物的研究[J]. 中藥材，2010，33(12): 1875 - 1877.

[7] AFIYATULLOV S S, KALINOVSKY A I, KUZNETSOVA T A, et al. New glycosides of the fungus acremonium striatisporum Isolated from a sea cucumber[J]. J Nat Prod, 2004, 67(6): 1047-1051.

[8] WANG F Z, FANG Y C, ZHU T J, et al. Seven new prenylated indole diketopiperazine alkaloids from holothurian-derived fungusAspergillusfumigatus[J]. Tetrahedron, 2008, 64(34) :7986-7991.

[9] XIA X K, ZHANG J Y, ZHANG Y G, et al. Pimarane diterpenes from the fungusEpicoccumsp. HS-1 associated withApostichopusjaponicus[J]. Bioorg Med Chem Lett, 2012, 22(8): 3017-3019.

[10] SUN P, XU D X, MANDI A, et al.Structure,absolute configuration, and conformational study of 12-membered macrolides from the fungusDendrodochiumsp. associated with the sea cucumberHolothurianobilisselenka[J]. J Org Chem, 2013, 78(14): 7030-7047.

[11]XU D X, SUN P, KURTN T, et al. Polyhydroxy cyclohexanols from aDendrodochiumsp. fungus associated with the sea cucumberHolothurianobilisselenka[J]. J Nat Prod, 2014, 77(5): 1179-1184.

[12] 阮沖，肖小華，李攻科. 天然產物有效成分提取分離制備方法研究進展[J]. 化學試劑，2014，36(3)：193-200.

[13] 陳尚钘，劉誠，范國榮，等. 天然產物中活性成分提取分離及分析技術[J]. 江西林業科技，2005(3):32-36.

[14] DETTRAKUL S, KITTAKOOP P, ISAKA M, et al. Antimycobacterial pimarane diterpenes from the fungusDiaporthesp.[J]. Bioorg Med Chem Lett, 2003, 13(7): 1253-1255.

【中藥與天然活性產物】

cucumber-derived fungusEpicoccumsp.by two-dimensional

high-throughput chromatography

QI Jun1,XIA Xue-kui1,JIA Ai-rong2,LIU Xin2,ZHANG Mian-song1,LIU Chang-heng2*

(1.Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Biotechnology Center, Shandong Academy

of Sciences, Jinan 250014, China；2.Biology Institute, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China)

Abstract∶We established a new method for separation and preparation of pimarane diterpenes from sea cucumber-derived fungus Epicoccum sp.by two-dimensional high-throughput chromatography.It was performed with MeOH-H2O as solvent, flow rate of 40 mL/min, main separation detection wavelength of 254 nm and second separation detection wavelength of 220 nm.Pimarane diterpenes were isolated from 1.5 g ethyl acetate extract fromsea cucumber-derived fungus Epicoccum sp.Their structureswere identified by spectroscopic data (1H NMR and MS).The method is simple and rapid, reduces irreversible sample adsorption,and provides a new approach for separation and preparation of pimarane diterpenes.

Key words∶two-dimensional high-throughput chromatography; sea cucumber-derived fungus; pimarane diterpenes

中圖分類號：R284.2

文獻標識碼：A

文章編號：1002-4026(2015)04-0014-05

作者簡介：齊君(1985-)，女，博士，助理研究員，研究方向為海洋天然產物。Email: qljbgreat@163.com

基金項目：山東省科學院科學技術發展計劃 (2014QN018)；國家自然科學基金 (81202452)；中韓國際合作交流項目 (81411140251)

收稿日期：2015-03-25

DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2015.04.003 10.3976/j.issn.1002-4026.2015.04.005