注射用紫杉醇(白蛋白結合型)過敏反應原因研究

高玉清　王彩霞　劉勛濤　王紅葉　王艷玲　耿玉茹　李春雷

注射用紫杉醇(白蛋白結合型)過敏反應原因研究

高玉清王彩霞劉勛濤王紅葉王艷玲耿玉茹李春雷

【摘要】目的探討注射用紫杉醇(白蛋白結合型)對豚鼠致敏作用的原因。方法從豚鼠血清免疫性試驗和大鼠腹腔肥大細胞組胺釋放兩個方面，評價注射用紫杉醇(白蛋白結合型)的致敏性。結果豚鼠抗注射用紫杉醇(白蛋白結合型)血清能與人血白蛋白產生沉淀線，與空白豚鼠血清不生成沉淀線;紫杉醇注射液1×10－3mg/ml、1× 10－4mg/ml和1×10－5mg/ml可以明顯促進大鼠腹腔肥大細胞組胺的釋放，組胺的釋放與劑量成正比，與陰性對照組相比具有顯著性差異，而注射用紫杉醇(白蛋白結合型)對大鼠腹腔肥大細胞組胺的釋放無影響。結論注射用紫杉醇(白蛋白結合型)對豚鼠的致敏作用是由其輔料-人血白蛋白引起的。

【關鍵詞】紫杉醇;白蛋白;致敏作用

【中圖分類號】R 392.33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002－7386(2015)16－2521－04

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.16.042

收稿日期:(2015－01－18)

項目來源:石家莊高端醫藥產業園區創新藥物孵化基地課題(編號:2011ZX09401-306)

作者單位: 050035石家莊市，石藥集團中奇制藥技術(石家莊)有限公司

通訊作者:李春雷，050035石家莊市，石藥集團中奇制藥技術(石家莊)有限公司;

紫杉醇為天然的廣譜抗腫瘤藥物，它通過促進微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白穩定，抑制細胞有絲分裂來實現抗腫瘤作用。紫杉醇對腫瘤細胞的微管具有特異性作用，因此被認為是G2/M期特異性化療藥物［1］。紫杉醇已經證明對多種惡性腫瘤具有明顯抗癌活性，包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、頭頸部腫瘤和胃癌等，是療效肯定、臨床應用廣泛的廣譜抗腫瘤藥物之一，已作為多個腫瘤的一線治療藥物［2］。但因其水溶性差，臨床使用需用聚氧乙烯蓖麻油與無水乙醇作為助溶劑，在體內易引起嚴重的過敏反應、脫髓鞘病變和神經元退行性病變，所以限制了它在臨床上的應用［3］。為了解決上述問題，美國Abraxis Bioscience，LLC公司研制出注射用紫杉醇(白蛋白結合型)納米制劑，商品名為Abraxane。它采用人血白蛋白(HSA)作為載體，通過高壓均質技術將紫杉醇和HSA制成紫杉醇結合白蛋白納米顆粒。由于處方中不含可導致嚴重過敏反應的溶劑Cremophor EL，因此不需要預先給予抗過敏藥物，并且可以將輸液時間縮短到30min以內，顯著增強了患者的順應性。我公司對該產品進行了仿制研發，并對自研注射用紫杉醇(白蛋白結合型)與Abraxane進行了豚鼠主動全身過敏試驗比較考察，結果發現兩藥對豚鼠均有相似的主動全身致敏作用。

1　材料與方法

1.1儀器與材料BHC－1000ⅡA/B3型生物安全柜(蘇州安泰空氣技術有限公司); IX70型倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司); HERAcell 150二氧化碳培養箱(德國Heraeus賀利氏); AL204電子分析天平(Mettler Toledo);多功能酶標儀: Thermo Fisher Scientific公司，型號Varioskan Flash;低速離心機:河北白洋離心機廠，型號B40型;高壓蒸汽滅菌器:日本sanyo電機株式會社，型號MLS－3780;超純水機:上海而立環保科技有限公司，型號Milli-Q Academic; Gel Doc XR +型凝膠成像儀: BIO-RAD;恒溫培養箱:北京市光明醫療儀器廠。

自研注射用紫杉醇(白蛋白結合型): 100mg，石藥集團中奇制藥技術(石家莊)有限責任公司，批號20121003;市售注射用紫杉醇(白蛋白結合型):商品名Abraxane，100mg，Abraxis BioScience，LLC生產，批

號6102309，進口藥品注冊證號H20091059;人血白蛋白:10 g/50ml，廣東雙林生物制藥有限公司，批號20111136;紫杉醇原料藥: 5 g/瓶，云南漢德生物技術有限公司，批號cp110302; PEG化蓖麻油(Cremophor EL):500 g/瓶，黃色油狀液體，巴斯夫有限公司，批號08550768E; Percoll(1.131 g/ml): Pharmaeia公司進口，北京索萊寶公司分裝，產品編號P8370; RPMI 1640培基:美國GiBco公司;大鼠組胺(HIS)ELISA檢測試劑盒: RD公司，批號20130401; 0.9%氯化鈉注射液: 0.9 g/100ml，石家莊四藥有限公司，批號120902166;瓊脂糖: amresco，1996B504-100G;氨基黑10B:天津市光復精密化工研究所，批號20110311;冰醋酸:國藥集團化學試劑有限公司，批號T20100507;甲醇: Fisher公司產品，批號111773;乙醇:西隴化工股份有限公司，批號110601;乙醚:天津市科密歐化學試劑有限公司，批號20120110。

SPF級健康hartley豚鼠，300～400 g，河北省實驗動物中心購得，實驗動物生產許可證號SYXK(冀)2008-1-003。SPF級健康SD大鼠，180～220 g，河北省實驗動物中心購得，實驗動物生產許可證號SYXK(冀)2008-1-003。動物飼養于清潔級環境，動物自由攝食、飲水，室溫20～25℃，濕度40%～70%，晝夜明暗交替時間12 h/12 h，實驗動物使用許可證號SYXK(冀)2011-0059。大鼠飲用無菌純化水，飼以標準大鼠料。

1.2方法

1.2.1主要溶液的配制:注射用紫杉醇(白蛋白結合型):用無菌注射器將0.9%氯化鈉注射液20ml沿瓶內壁緩慢注入，靜置5min后，輕輕搖動藥瓶，讓瓶內所用凍干粉完全分散溶解。

MOOC在國內的落地生根與持續發展，必須與國內政策與法律環境相適應，必須與國內用戶的實際需求相契合。由已有研究內容可知，國內圖書館界主要側重介紹國外圖書館參與MOOC的理論成果與實踐經驗，而基于國內文化及教育管理體制、知識產權法律法規、用戶群體分布、圖書館人才儲備及技術力量等實際，探討MOOC環境下國內圖書館功能重構與機構重組，探討國內圖書館在MOOC課程制作、MOOC資源標引與描述、MOOC資源整合與檢索、MOOC資源宣傳與推介、MOOC學習輔導、MOOC質量評價、MOOC教學效果評估等方面及環節中本土化的理論研究還很少，也少有圖書館做出相應的本土化嘗試。

紫杉醇注射液(Taxol):按紫杉醇注射液配方進行配制，紫杉醇0.65mg，無水乙醇42mg，PEG化蓖麻油57mg，即含1mg紫杉醇的溶液重量為153.3mg。

等滲的100% Percoll溶液配制:在無菌條件下，取9倍體積的1.131 g/ml Percoll溶液加入1倍體積的1.5m NaCl溶液(10×0.9%氯化鈉溶液)混合配制成等滲的Percoll溶液，現用現配。

30%的Percoll溶液配制:取3倍體積的100%等滲Percoll溶液加入7倍體積的0.9%氯化鈉溶液溶液。

80%的Percoll溶液配制:取8倍體積的100%等滲Percoll溶液加入2倍體積的0.9%氯化鈉溶液溶液。

氨基黑染色液:氨基黑10B 0.5107 g，溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合溶液中。

1.5%瓊脂的配制:稱0.15 g瓊脂糖，加入10ml水，微波爐中小功率加熱20 s，使瓊脂完全溶脹。

漂洗液:量取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml混勻。

1.2.2藥物對豚鼠血清免疫性試驗

1.2.2.1抗血清的制備方法:選用SPF級hartley豚鼠18只，參照普通拉丁方均分3組，每組雌雄各3只，分別是對照藥Abraxane組、自研藥注射用紫杉醇(白蛋白結合型)組和陰性對照組。對照藥組和自研藥組按照預實驗確定的劑量給藥0.625mg/只，給藥容積為0.5ml/只，陰性對照組給予等容積的0.9%氯化鈉注射液;給藥方式為隔日一次腹腔給藥，共三次;末次給藥后的第11天將豚鼠進行乙醚麻醉，腹主動脈取血，于滅菌后的15ml離心管內靜置，離心3 000 r/min ×15min，取上清，為所需要的抗血清。

1.2.2.2空白豚鼠血清的制備:選用SPF級hartley豚鼠6只，進行乙醚麻醉，腹主動脈取血，于滅菌后的15ml離心管內靜置，離心3 000 r/min×15min，取上清，為所需要的空白豚鼠血清。

1.2.2.3免疫雙擴散試驗［4］:取干凈的載玻片，平放于實驗臺(臺面要水平)，將融化的瓊脂趁熱加在載玻片上(約加4ml)，使瓊脂鋪滿整個玻片的表面(注意勿使瓊脂流出玻片之外)，令其在室溫下冷卻凝固。然后用自制打孔器(內徑2～3mm)在瓊脂上打孔，并用針頭小心地將打好的孔中的瓊脂挑出，不要觸及孔周圍的瓊脂。打好孔后，在凝膠的左上角打孔作為標記。中央孔加入抗血清，周邊孔加入供試品溶液及陽性對照血清，每孔加樣20 μl，放置濕盒中，37℃水平擴散24 h，然后用生理氯化鈉溶液充分浸泡瓊脂糖凝膠板24 h后，放入0.5%氨基黑溶液中染色，用脫色液脫色至背景無色，沉淀線呈清晰為止。

1.2.3藥物對大鼠腹腔肥大細胞組胺釋放的影響［5］:在過敏反應與類過敏反應中，肥大細胞脫顆粒釋放出多種炎性介質，引起過敏癥狀。肥大細胞在脫顆粒時會大量釋放組胺，它是引起過敏及類過敏反應的主要活性物質。檢測肥大細胞釋放組胺的量，可以了解肥大細胞的脫顆粒情況，從而評價藥物的致類過敏性。1.2.3.1分離大鼠腹腔肥大細胞(rat peritonealmast cells，RPMC)方法: CO2窒息機使SD大鼠昏迷，頸動脈放血處死，將大鼠(除頭部)浸入75%乙醇消毒2～3min。將消毒后的大鼠固定于超凈臺內消毒木板上，用75%乙醇棉球消毒皮膚，腹腔注射預冷的RPMI-

1640液15ml，輕輕按摩腹部3min。在無菌條件下切開腹腔，吸取腹腔沖洗液置于離心管中，1 500 r/min，離心10min。離心物棄去上清液，用冷的RPMI-1640液重懸細胞。取細胞懸液，緩慢加入30%:80%的percoll梯度分離液上層，2 500 r/min離心15min。收集下2/3層細胞，用RPMI-1640液清洗2次，1 500 r/min，離心10min。將細胞置于冰上備用。

1.2.3.2藥物與肥大細胞的作用: 96孔板中每孔加入肥大細胞懸液200 μl，每孔細胞數2×105/孔，37℃水浴預孵5min。分別加入50 μl各濃度藥物使成不同的終濃度(藥物終濃度分別為1×10－3、1×10－4和1×10－5mg/ml)，陰性對照加入等量藥物稀釋液(0.9%氯化鈉溶液)，每孔3復孔，繼續孵育60min，然后將96孔板置－20℃終止反應。3 000 r/min離心10min分離細胞。上清液封裝于1.5ml小管中，－20℃保存待測。

1.2.3.3組胺檢測:采用大鼠組胺ELISA檢測試劑盒檢測上述溶液中組胺的量。

2　結果

2.1免疫雙擴散試驗結果豚鼠抗對照藥血清能與人血白蛋白、對照藥和自研藥產生沉淀線，與空白豚鼠血清不生成沉淀線，進而證明對照藥引發的豚鼠過敏反應是由于異原白蛋白引起的免疫反應。見圖1。

圖1　免疫雙擴散實驗結果

2.2藥物對大鼠腹腔肥大細胞組胺釋放的影響結果

紫杉醇注射液1×10－3mg/ml、1×10－4mg/ml和1×10－5mg/ml可以明顯促進大鼠腹腔肥大細胞組胺的釋放，組胺的釋放與劑量成正比，與陰性對照組比較差異有顯著性。與陰性對照組相比，相同濃度的自研注射用紫杉醇(白蛋白結合型)和市售注射用紫杉醇(白蛋白結合型)對大鼠腹腔肥大細胞組胺的釋放無影響。與等濃度的自研注射用紫杉醇(白蛋白結合型)和市售注射用紫杉醇(白蛋白結合型)相比，紫杉醇注射液1×10－3mg/ml和1×10－4mg/ml濃度對大鼠腹腔肥大細胞組胺的釋放顯著增加。自研注射用紫杉醇(白蛋白結合型)和市售注射用紫杉醇(白蛋白結合型)對大鼠腹腔肥大細胞組胺釋放差異無統計學意義。見表1。

表1　藥物對大鼠腹腔肥大細胞組胺釋放的影響

3　討論

由于紫杉醇在水中不溶，因此將其開發成注射劑的難點就是改善它的溶解性。目前國內市售紫杉醇制劑包括三種，紫杉醇注射液、注射用紫杉醇脂質體和注射用紫杉醇(白蛋白結合型)。紫杉醇注射液為百時美施貴寶公司研制，商品名為Taxol，1993年在美國上市。該品采用聚氧乙烯蓖麻油作為增溶劑，會引起嚴重的過敏反應，因此給藥前需要使用地塞米松、苯海拉明和H2受體拮抗劑對患者進行預處理。注射用紫杉醇脂質體為南京思科藥業有限公司研制，商品名為力撲素，于2003年在中國首次上市。該品雖然較普通注射液過敏性有所減輕，但給藥前30min仍需進行抗過敏預處理。注射用紫杉醇(白蛋白結合型)為Abraxis Bioscience，LLC研制，商品名為Abraxane，于2005年在美國上市，2009年進入中國，其在臨床應用上，不需進行抗過敏預處理，用藥更加安全。

石藥集團仿制Abraxane研發了注射用紫杉醇(白蛋白結合型)，豚鼠主動全身過敏試驗發現石藥集團的注射用紫杉醇(白蛋白結合型)和Abraxane對豚鼠均有主動全身致敏作用，致敏癥狀基本一致。為了解釋注射用紫杉醇(白蛋白結合型)產生致敏的原因，我們進行了大鼠腹腔肥大細胞組胺釋放試驗和免疫雙擴散試驗。

在過敏反應與類過敏反應中，肥大細胞脫顆粒釋放出多種炎性介質，引起過敏癥狀。肥大細胞在脫顆粒時會大量釋放組胺，它是引起過敏及類過敏反應的主要活性物質［5］。檢測肥大細胞釋放組胺的量，可以了解肥大細胞的脫顆粒情況，從而評價藥物的致類過敏性。Taxol的過敏反應是由于Cremophor EL(聚氧乙烯蓖麻油)促進組胺釋放引起的。本研究結果已經證明，紫杉醇注射液1×10－3、1×10－4和1×10－5mg/ml

可以明顯促進大鼠腹腔肥大細胞組胺的釋放，組胺的釋放與劑量成正比，與陰性對照組相比具有顯著性差異。

注射用紫杉醇(白蛋白結合型)由于不含有Cremophor EL，不會引起組胺釋放，從而不產生過敏反應，然而石藥集團開發的注射用紫杉醇(白蛋白結合型)和Abraxane，對豚鼠均有主動全身致敏作用，為了解釋注射用紫杉醇(白蛋白結合型)產生致敏的原因，我們進行了免疫雙擴散試驗。注射用紫杉醇(白蛋白結合型)之所以對豚鼠有主動全身致敏作用，是由輔料HSA進入豚鼠體內后產生的免疫反應引起的。HAS對于豚鼠來說，是一種異源蛋白，重復給藥后，免疫系統必然應答，從而產生抗體。因此自研注射用紫杉醇(白蛋白結合型)與Abraxane所引發的豚鼠過敏反應原因一致，都是由于輔料HAS引起的免疫反應。而HAS是人的內源性蛋白，因此注射用紫杉醇(白蛋白結合型)對豚鼠產生的全身主動過敏癥狀在人身上不會發生。

參考文獻

1 Schiff PB，Fant J，Horwitz SB.Promotion ofmicrotubule assembly in vitro by taxol.Nature，1979，277:665-667.

2 Rowinsky EK.Update on the antitumor activity of paclitaxel in clinical trials.Ann Pharmacother，1994，28: S18-22.

3 Gelderblom H，Verweij J，Nooter K，et al.Cremophor EL: the drawbacks and advantages of vehicle selection for drug formulation.Eur J Cancer，2001，37:1590-1598.

4中華人民共和國藥典委員會主編.中國藥典·2010年版三部.北京:中國醫藥科技出版社，附錄ⅧC.

5 Krüger PG，Mahata SK，Helle KB.Catestatin(CgA344-364)stimulates ratmast cell release of histamine in amanner comparable tomastoparan and other cationic charged neuropeptides.Regul Pept，2003，114:29-35.