胃癌中凋亡抑制蛋白的表達與化療耐藥的關系

曹曉靜　白玉潔　宋曉翠　杜麗艷　楊德志　馬超　宋曉昕　張春山

胃癌中凋亡抑制蛋白的表達與化療耐藥的關系

曹曉靜白玉潔宋曉翠杜麗艷楊德志馬超宋曉昕張春山

【摘要】目的探討胃癌組織中Livin、Survivin的表達與化療藥敏性的關系。方法收集102例胃癌標本，用免疫組織化學檢測Livin和Survivin的表達。新鮮胃癌組織制備單細胞懸液，分別加入6種化療藥物(奧沙利鉑、氟尿嘧啶、順鉑、紫杉醇、阿霉素、環磷酰胺)培養48 h，MTT法觀察藥物作用后癌細胞活性變化。結果Livin、Survivin在胃癌組織中表達明顯高于組織(P＜0.05)。Livin在胃癌組織中高表達時，與奧沙利鉑、氟尿嘧啶、順鉑耐藥性有關(P＜0.05)。Survivin高表達時，對順鉑、阿霉素、環磷酰胺耐藥性有關(P＜0.05)。結論腫瘤中Livin、Survivin的過表達與部分化療藥物耐藥有關。

【關鍵詞】胃癌;化療藥物; Livin; Survivin

【中圖分類號】R 735.2

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002－7386(2015)16－2415－03

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.16.004

【Abstract】Objective To investigate the correlation between the expression of Livin，Survivin and chemotherapeutic drug resistance in gastric cancer.Methods One hundred and two specimens of gastric cancer were colleted，and the expression levels of Livin，Survivin were detected by immunohistochemistry.The single cell suspension was prepared with fresh tumor tissue，then 6 kinds of chemotherapeutic drugs including oxaliplatin，fluorouracil，cisplatin，paclitaxel，adriamycin，cyclophosphamide were added into the suspension which was cultured for 48 hours，finally the changes of cancer cell activity were observed bymTT.Results The expression levels of Livin and Survivin in gastric cancer tissue were significantly higher than those of normal tissues(P＜0.05).The high expression of Livin in gastric cancer was correlated to the drug resistance of oxaliplatin，fluorouracil，cisplatin(P＜0.05).The high expression of Survivin was related with the drug resistance of cisplatin，adriamycin，cyclophosphamide(P＜0.05).Conclusion The overexpression of Livin，the and Survivin is correlated to the part of chemotherapeutic drug resistance in gastric cancer.

收稿日期:(2015－01－20)

作者單位: 054001河北省邢臺市第一醫院胃腸外科(曹曉靜、宋曉翠、杜麗艷、楊德志、馬超、張春山)，病理科(宋曉昕);河北省邢臺市第二醫院外科(白玉潔)

Study on the expression of Livin，Survivin and chemotherapeutic drug resistance in gastric cancer

CAO Xiaojing*，BAI Yujie，SONG Xiaocui*，et al.*Department of Gastrointestinal Surgery，The First Hospital of Xingtai City，Hebei，Xingtai 054001，China

【Key words】gastric carcinoma; chemotherapeutic drug; Livin; Survivin

在我國早期胃癌診斷率低，胃癌經常到晚期才得到診斷，因而化療在胃癌治療中占據非常重要地位。但化療耐藥性成為阻礙化療效果提高的主要因素之一。胃癌耐藥機制的研究一直是國內外的熱點，細胞凋亡異常是耐藥機制之一。我們選取102例胃癌組織和11例正常胃組織，檢測了凋亡抑制蛋白Livin、Survivin的表達情況，并分析與6種常見化療藥物耐藥性的關系。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇邢臺市第一醫院2010年6月至2012年6月間經手術切除胃組織標本102例，正常胃組織(非腫瘤性疾病)11例。其中男64例，女38例，男女之比為1.68∶1;年齡25～81歲，中位年齡58歲。所有標本均為手術切除新鮮組織標本。標本切下后，立即原發灶兩個部位分別切取1 cm×0.5 cm×0.5 cm大小組織塊，置入雙抗培養液行噻唑藍(MTT)法腫瘤細胞化療藥物敏感性實驗。另外每例新鮮組織標本使用中性甲醛溶液固定，再經石蠟包埋、切片，進行免疫組化檢測。

1.2免疫組化法檢測Livin、Survivin蛋白的表達兔

抗人Livin多克隆抗體、Survivin多克隆抗體分別購買于武漢博士德生物工程有限公司、Zemet公司。采用免疫組化過氧化物酶標記鏈霉卵白素法(SP)，Livin工作濃度為1∶50，Survivin工作濃度為1∶50。使用PBS溶液代替一抗做陰性對照，應用微波抗原修復。由兩位經驗豐富的病理科醫生采用雙盲閱片。每例每個指標隨機取5個(×400)高倍視野，按照半定量積分方法記錄結果。根據免疫組化染色反應的深度及陽性細胞的數量分別記分。無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞數≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75% 為3分，＞75%為4分。兩項指標分值的成績分為4級，0～1分為陰性(－)，2～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。

1.3mTT藥物敏感實驗取新鮮標本制備胃癌細胞懸液。取胃癌細胞懸液加入培養板，每孔200 μg。用藥組:分別加入藥物終濃度為10倍血漿峰值濃度的6種化療藥物，分別是奧沙利鉑(L-OHP)、氟尿嘧啶(5-Fu)、順鉑(DDP)、紫杉醇(PTX)、阿霉素(ADM)、環磷酰胺(CTX)，每組設立3個復孔。對照組:不加藥物的細胞。置于37℃、CO2培養箱中，培養48 h，各孔加入MTT(5 g/L)20 μl，繼續培養4 h，終止培養后應用顯微鏡觀察細胞變化。應用酶標儀570 nm波長處檢測各孔吸光度值(A)。腫瘤細胞抑制率=(1－用藥組平均A值/對照組平均A值)×100%。判斷標準:當腫瘤細胞抑制率＜30%時為不敏感(耐藥)，＞30%時為敏感。

1.4統計學分析應用SPSS 17.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗、秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1胃癌組織中Livin、Survivin的表達及意義顯微鏡下觀察，Livin蛋白主要位于胃癌細胞的細胞質和細胞核，而Survivin蛋白主要位于胃癌細胞的細胞質，均表現為黃色或棕黃色顆粒。在102例胃癌組織中Livin、Survivin的表達明顯高于正常胃組織(71.5%和76.5%，P＜0.05)。結果分析顯示，Livin蛋白的表達和胃癌組織分化程度、有無淋巴結轉移明顯相關(P＜0.05)，但與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤浸潤深度及胃癌TNM分期臨床病理因素無關(P＞0.05)。Survivin蛋白的表達與腫瘤分化程度明顯相關(P＜0.05)。Survivin的表達與患者的年齡、性別、腫瘤大小、浸潤深度及TNM分期臨床病理因素無關(P＞0.05)。在選取的11例正常胃黏膜組織中，無Livin蛋白表達，但有1例胃組織Survivin表達陽性(9.1%)，經統計學分析，胃癌組織中Survivin蛋白的表達明顯高于正常胃組織(P＜0.05)。見表1、圖1～2。

表1　胃癌組織中Livin和Survivin表達及意義

圖2　Survivin在胃癌組織的表達(SP×400)

圖1　Livin在胃癌組織的表達(SP×400)

2.2胃癌中Livin、Survivin表達與化療藥物敏感性關系本實驗MTT法藥敏實驗成功102例，應用化療藥物作用48 h后，觀察可見細胞受損明顯，表現為活動力的降低，數量的減少，失去貼壁能力，細胞內空泡增加，完整性受到破壞，形成細胞碎片。本次MTT檢測結果顯示，不同個體胃癌細胞對化療藥物敏感性不同。Livin陽性表達組中，奧沙利鉑、氟尿嘧啶、順鉑對腫瘤細胞的抑制率明顯低于弱表達組(P＜0.05)，但紫杉醇對腫瘤細胞的抑制率則明顯增加(P＜0.05)。在Survivin陽性表達組中，順鉑、阿霉素、環磷酰胺對腫瘤細胞的抑制率明顯降低(P＜0.05)，但紫杉醇對腫瘤細胞的抑制率則明顯增加(P＜0.05)。見表2。

表2　胃癌組織Livin、Survivin表達與化療藥敏的關系%，x±s

表2　胃癌組織Livin、Survivin表達與化療藥敏的關系%，x±s

臨床病理因素Livin陽性　陰性　χ2值　P值Survivin陽性　陰性　χ2值　P值L-OHP耐藥(n =31)　30　 1　 8.124＜0.05　 25　 6　 0.978　　＞0.05敏感(n =60)　43　 17　53　 7 5-Fu耐藥(n =35)　32　 3　 10.328＜0.05　 24　 11　 1.848　?。?.05敏感(n =67)　41　 26　54　 13 DDP耐藥(n =33)　30　 3　 8.968＜0.05　 31　 2　 8.273　　＜0.05敏感(n =69)　43　 26　47　 22 PTX耐藥(n =20)　11　 9　 3.356＞0.05　 12　 8　 3.751　?。?.05敏感(n =82)　62　 20　66　 16 ADM耐藥(n =36)　25　 11　 0.123＞0.05　 32　 4　 4.768　?。?.05敏感(n =66)　48　 18　46　 20 CTX耐藥(n =29)　20　 9　 0.153＞0.05　 27　 2　 6.230　?。?.05敏感(n =73)53　 20　51　 22

3　討論

胃癌在世界范圍內國發病率和死亡率都很高。近年來，雖然胃癌的治療取得了明顯的進步，但在我國仍然是導致惡性腫瘤死亡的重要原因，胃癌的化療耐藥性是導致高死亡率的原因之一。胃癌耐藥的主要機制之一細胞凋亡耐藥。細胞凋亡耐藥是指促凋亡基因的缺失或抗凋亡基因的過度表達導致腫瘤細胞耐受凋亡而對化療耐藥。近期研究發現，凋亡抑制蛋白(IAP)家族是具有重要的抗細胞凋亡作用，其中Livin和Survivin是重要凋亡抑制因子［1］，在許多惡性腫瘤中［2－7］，如胃癌、結直腸癌、鱗狀細胞癌、前列腺癌、淋巴瘤、神經母細胞瘤、白血病等，Livin均呈高表達。其作用機制直接或間接調控Caspase信號途徑，破壞了細胞的增殖和凋亡之間的平衡，導致腫瘤發生、發展密切相關。而許多化療藥物作為細胞凋亡誘導劑，通過損傷細胞DNA，將信號經不同途徑傳遞到凋亡控制點啟動凋亡，經過一系列酶聯反應，最終活化凋亡效應分子Caspase、切割DNA產生細胞凋亡發揮抗腫瘤作用［8］。由此，我們考慮到胃癌中Livin和Survivin的表達是否與化療藥物耐藥性有關。我們研究檢測了凋亡抑制蛋白Livin、Survivin在胃癌組織中的表達，并采用MTT法檢測了胃癌細胞對常用的6種化療藥物的敏感性，分析其與化療藥物耐藥性的關系。

我們的實驗結果顯示:在胃癌組織中Livin和Survivin的表達明顯高于正常胃組織(P＜0.05)，Livin、 Survivin表達與腫瘤組織分化密切相關(P＜0.05)，另外Livin過表達與淋巴結轉移還密切相關(P＜0.05)。研究說明，胃癌組織分化越差，Livin、Survivin的表達可能越高。Livin、Survivin的表達越高，使腫瘤細胞凋亡越不足，促使惡性轉化的細胞異常增多，加速腫瘤發生、發展。

本研究一重要結果顯示，在胃癌組織Livin高表達組中，與奧沙利鉑、氟尿嘧啶、順鉑耐藥性有關。Survivin高表達時，與順鉑、阿霉素、環磷酰胺耐藥性有關。與有關的研究［9］一致，即Survivin高表達時，與順鉑、阿霉素耐藥有關。由此可見，Livin、Survivin表達與部分化療藥物耐藥性有關，可能是由于作用于凋亡通路不同位點導致效果不一。我們的研究是在體外進行的，即將化療藥物和腫瘤細胞在離體情況下充分接觸，而藥物在人體內分布狀況、代謝規律、排泄速度和體外實驗有很大差異。然而，許多研究已證實，體外藥敏實驗不敏感者，在體內用藥也常常耐藥。因此，我們希望通過更多更完善研究能夠篩選敏感化療藥物，克服化療藥耐藥性，指導腫瘤的臨床用藥。

參考文獻

1 Chen YS，Li HR，Linm，et al.Livin abrogates apoptosis of SPC-A1 cell by regulating JNKI signaling pathway.Mol Biol Rep，2010，37: 2241-2247.

2余曉萍，張艷，朱翠明，等.Livin的siRNA對胃癌細胞BGC823生長與功能影響的初步研究.中華腫瘤防治雜志，2010，17:1722-1726.

3王永，宋怡才，尹作文，等.LivinmRNA在結直腸癌、腺瘤和正常黏膜中的表達差異及意義.中華普通外科學文獻，2011，5:195-197.

4 Dasgupta A，Alvarado CS，Xu Z，et al.Expression and functional role of inhibitor-of-apoptosis protein Livin(BIRC7)in neuroblastoma.Biochem Biophys Res Commun，2010，400:53-59.

5 Ye L，Song X，Li S，et al.Livin-alpha promotes cell proliferation by rugulating G1-S cell cycle transition in prostate cancer.Prostate，2011，71:42-51.

6 Gao JM，Wang X，Liu XQ，et al.Clinical significance of Livin expression in non-Hodgkin’s lymphoma.Zhongguo Shi Yan Xue Yi Xue Za Zhi，2010，18:385-390.

7 Yang YL，Lin SR，Chen JS，et al.Expression and prognostic significance of the apoptotic genes BCL2L13，Livin and CASP8AP2 in childhood acute lymphoblastic leukemia.Leuk Res，2010，34:18-23.

8 Foroutan B，Zitzelsberger H，Bauer V，et al.Molecular cytogenetic analysis of chemoresistant non-Hodgkin，s lymphoma patients with p53 abnormalities using fluorescence in situ hybriditsaion and comparative genomic hybridisation.Arch Iranmed，2011，14:321-326.

9檀碧波，李勇，范立僑，等.胃癌凋亡相關蛋白Survivin、B淋巴細胞/白血病-2、bax表達與腫瘤細胞體外化療敏感性的關系.中華實驗外科雜志，2012，29:1315-1317.