金蓮花總黃酮對人甲狀腺乳頭癌K1細胞三葉因子3表達變化的影響

房濤　張靜　吳靖芳　張文靜　張晨磊　張蕓蕓　裴達

金蓮花總黃酮對人甲狀腺乳頭癌K1細胞三葉因子3表達變化的影響

房濤張靜吳靖芳張文靜張晨磊張蕓蕓裴達

【摘要】目的探討金蓮花總黃酮對人甲狀腺乳頭癌K1細胞增殖抑制作用及三葉因子3(TFF3)表達變化。方法不同濃度金蓮花總黃酮作用于體外培養K1細胞24、48、72 h，MTT檢測細胞生長抑制率，Western blotting和Real-time PCR檢測不同濃度總黃酮對K1細胞TFF3蛋白及mRNA表達的影響。結果MTT實驗結果表明，同一時間總黃酮對K1細胞生長增殖抑制率隨著藥物濃度的增高而升高(P＜0.05)，同一濃度總黃酮對K1細胞抑制率隨時間延長而升高(P＜0.05)。Western blot及QPCR結果顯示隨著金蓮花總黃酮濃度的升高K1細胞TFF3蛋白及mRNA水平下降(P＜0.05)。結論金蓮花總黃酮對人甲狀腺乳頭癌細胞具有抑制作用，并能抑制TFF3的表達。

【關鍵詞】金蓮花總黃酮;乳頭狀甲狀腺癌;三葉因子3

【中圖分類號】R 736.1

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002－7386(2015)16－2405－03

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.16.001

【ABSTRACT】Objective To investigate the inhibition effect of Trollius flavonoids on the proliferation of Trefoil factor 3(TFF3)in human papillary thyroid cancer K1 cells in vitro，and to explore its effect on the expression of TFF3 in K1 cells.Methods The K1 cells cultured in vitro were treated by different concentrations of Trollius flavonoids for 24h，48h，72h，respectively，then the inhibition rate on K1 cells growth was dectected bymTT.The changes of expression of TFF3 protein/mRNA were detected by Western blotting and Real-time PCR，respectively.ResultsmTT detection showed that Trollius flavonoids had inhibition effects on proliferation and growth of K1 cells in a dose and time dependentmanner(P＜0.05).The examination results by Western blotting and Real-time PCR showed that the expression levels of TFF3 protein andmRNA of K1 cells were decreased with the increase of flavonoids concentration(P＜0.05).Conclusion Trollius flavonoids have the inhibition effect on human throid papillary cancer cells and can inhibit the expression of TFF3.

收稿日期:(2015－04－11)

項目來源:河北省中醫藥管理局課題(編號:2013079)

作者單位: 075000河北省張家口市第一醫院外科(房濤);河北北方學院組織胚胎學教研室(張靜、吳靖芳、張文靜)，2012級臨床本科(張晨磊、張蕓蕓、裴達)

通訊作者:張靜，075000河北省張家口市，河北北方學院組織胚胎學教研室;

E-mail: zjokokok@163.com

Effects of Trollius flavonoids on the expression of Trefoil factor 3 in human papillary thyroid cancer K1 cells in vitro

FANG Tao，ZHANG Jing，WU Jingfang，et al.Department of Surgery，The First Hospital of Zhangjiakou City，Hebei，Zhangjiakou 075000，China

【Key words】Trollius flavonoids; papillary thyroid cancer; Trefoil factor 3

甲狀腺癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，病理類型以乳頭狀癌最為多見，其惡性程度、淋巴結轉移與否影響手術方式及術后生存率。金蓮花有效成分總黃酮具有抗菌、抗病毒、抗氧化作用，能夠抑制腫瘤生長。三葉因子3(trefoil factor 3，TFF3)是一類具有三個環狀結構的多肽，主要由黏液分泌細胞分泌，是重要的黏膜保護和修復因子。有研究發現，三葉因子家族在腸癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中高表達［1－3］，具有促侵襲、抗凋亡、促血管生成等作用。課題組前期研究發現TFF3在甲狀腺乳頭癌組織中表達明顯升高，與腫瘤分級和淋巴結轉移具有相關性［4］。

本研究采用不同濃度金蓮花總黃酮作用于體外培養甲狀腺乳頭癌K1細胞，應用MTT法檢測對細胞增殖的影響，采用Western blot和Real-time PCR檢測K1細胞TFF3蛋白及mRNA表達變化，探討金蓮花對甲狀腺乳頭癌細胞的影響以及TFF3作為甲狀腺乳頭癌診斷標記物的可能性。

1　材料與方法

1.1主要試劑與儀器人甲狀腺乳頭癌K1細胞由河北北方學院形態學實驗室贈予。金蓮花總黃酮由河北北方學院生命科學中心贈予。1640培養基(Gibco公司)，胎牛血清(天津市川頁生化制品有限公司)，MTT(Solarbio公司)，TFF3小鼠抗人單克隆抗體(Santa Cruze)，β-actin兔多克隆抗體(北京康為世紀生物科技有限公司)，HRP標記羊抗兔IgG(北京康為世紀生物科技有限公司)，單鏈cDNA合成試劑盒(GenecopoeiaTM)，RealmasterMix(SYBR Green)(天根生化科技有限公司)，ECL發光試劑盒(碧云天生物技術研究所)，Tanon-5200化學發光成像系統，實時熒光定量

PCR儀qtower2.2(德國耶拿公司)，Multiskan FC酶標儀(Thermo Fisher上海儀器有限公司)。

1.2金蓮花總黃酮金蓮花總黃酮40mg溶于100ml PBS中，高壓滅菌15min，4℃保存。1640培養液將金蓮花黃酮稀釋，設0、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8mg/ml 7個不同濃度。

1.3 K1細胞培養細胞用含10%胎牛血清的1640培養基，37℃、5% CO2條件下培養。取對數生長期細胞接種于96孔板，用不同濃度金蓮花總黃酮處理不同時間。

1.4 mTT法檢測金蓮花總黃酮對K1細胞的抑制作用取對數生長期密度為5×104/ml的K1細胞，接種于96孔培養板，100 μl/孔，邊緣孔用無菌PBS填充。5% CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底，加入不同濃度的總黃酮，100 μl/孔，設6個復孔。5% CO2，37℃分別培養24、48、72 h后每孔加入20 μl 0.5%mTT溶液，繼續培養4 h后終止培養，小心吸去孔內培養液，每孔加入150 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD 490 nm處測量各孔的吸光值，計算藥物對細胞的增殖抑制率。同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細胞、培養液、MTT、二甲基亞砜)。抑制率=(1－OD加藥/OD對照)×100%。

1.5 Western blot檢測不同濃度金蓮花總黃酮對K1細胞TFF3蛋白水平的影響K1細胞以每孔25×104個細胞數接種于6孔板，次日分別加入0.8、1.6、6.4mg/ml金蓮花總黃酮溶液，5% CO2，37℃孵育48 h，提取細胞蛋白，BCA測蛋白濃度，每孔50 μg蛋白質樣品進行12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜(60 V恒壓，TFF3:30min，β-actin:90min)，奶粉封閉，孵育一抗(TFF3為1∶500，β-actin為1∶5 000)，4℃過夜，加入辣根過氧化物標記的山羊抗鼠/兔抗體(1∶5 000)，ECL發光顯色，Image J分析條帶灰度，以目的蛋白的條帶灰度與β-actin的灰度比值表示蛋白的表達水平。

1.6 Real-time Quantitative PCR(QPCR)檢測不同濃度金蓮花總黃酮對K1細胞TFF3mRNA水平的影響細胞培養及藥物加入同上(1.5 Western blot檢測)，提取細胞RNA，反轉錄成cDNA，按照Real-time PCR試劑盒說明配制預混試劑，設定程序進行Real-time PCR反應。結果以delta delta CT方法來計算，表示TFF3mRNA表達水平。TFF3、β-actin引物由北京賽百盛生物工程技術有限公司合成。TFF3上游引物5’-AATGCACCTTCTGAGGCACCT-3’，下游引物5’-CGTTAAGACATCAGGCTCC AGA T-3’;β-actin上游引物5’-CCTGGGCATGGAGTCCTGTG-3’，下游引物5’-AGGGGCCGGACT CGTCATAC-3’。

1.7統計學分析應用SPSS 18.0統計軟件，計量資料以±s表示，各組數據行ANOVA方差分析及q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1金蓮花總黃酮對K1細胞生長抑制率的影響

MTT實驗結果表明，同一時間不同濃度總黃酮均對K1細胞生長增殖抑制率隨著藥物濃度的增高而升高(P＜0.05)，不同時間，同一濃度總黃酮對K1細胞抑制率隨時間延長而升高(P＜0.05)。見表1。

表1　MTT法檢測金蓮花總黃酮對K1細胞生長增殖抑制率的影響x±s

表1　MTT法檢測金蓮花總黃酮對K1細胞生長增殖抑制率的影響x±s

注:相同時間點，與前一個濃度比較，*P＜0.05;相同濃度，與前一時間點比較，#P＜0.05

藥物濃度(mg/ml)24 h　48 h　72 h 0 0 0 0 0.4　 0.14±0.04*　0.21±0.05* #　0.28±0.06* #0.8　 0.23±0.06*　0.31±0.05* #　0.40±0.07* #1.6　 0.37±0.06*　0.48±0.07* #　0.58±0.11* #3.2　 0.44±0.07　0.54±0.08#　0.64±0.08#6.4　 0.59±0.11*　0.64±0.09* #　0.79±0.07* #12.8　 0.75±0.10*　0.76±0.07*　0.85±0.05*#

2.2 Western blot檢測TFF3蛋白結果結果顯示TFF3蛋白條帶位于9 kDa處，內參β-actin反應條帶位于42 kDa處。TFF3蛋白條帶在隨藥物濃度升高顏色依次變淺。TFF3反應條帶半定量分析結果顯示隨著加藥濃度的升高TFF3蛋白表達量依次減少(P＜0.05)。見圖1，表2。±s2.3 QPCR檢測TFF3mRNA結果應用Real-time Quantitative PCR檢測不同濃度金蓮花總黃酮對甲狀腺乳頭狀癌細胞K1細胞TFF3基因表達變化的影響。基因的溶解曲線呈單峰(圖2，3)，說明引物特異性好，擴增產物單一。采用△△CT相對定量法計算基因拷貝的倍數變化，公式為: F =2－［(待測組目的基因CT 值-待測組內參基因CT值)－(對照組目的基因CT值

－對照組內參基因CT值)］。設定未加藥組(0mg/ml)倍數變化為1，其他濃度計算值為0mg/ml的倍數，隨著藥物濃度的升高，TFF3mRNA表達逐漸降低。見表3。

圖1　TFF3蛋白Western blot檢測結果

表2　Western blot檢測金蓮花總黃酮對K1細胞TFF3蛋白表達的影響

圖2　β-actin融解曲線

圖3　TFF3融解曲線圖

表3　Real time PCR檢測金蓮花總黃酮對K1細胞TFF3mRNA的影響

3　討論

近幾年甲狀腺癌在全世界發病率呈上升趨勢。根據病理分型，甲狀腺癌可分為乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)、濾泡狀癌(follicular thyroid carcinoma，FTC)、未分化癌(undifferentiated thyroid carcinoma，UTC)及髓樣癌(medullary thyroid carcinoma，MTC)，其中乳頭狀癌較為常見，目前治療方法主要為外科手術切除+碘131內照射治療+甲狀腺素替代治療，而中藥輔助治療惡性腫瘤已成為國內外抗癌藥物研究的重要內容，能抑制腫瘤生長并避免西藥所產生的不良反應。金蓮花屬于毛莨科金蓮花屬金蓮花的干燥花及花蕾，具有清熱解毒的作用，現代藥理進一步研究表明金蓮花主要有效成分黃酮類對人乳腺癌細胞，人結腸癌細胞，人食管癌細胞增殖具有抑制作用［5－7］。本實驗采用MTT法測定金蓮花總黃酮對人甲狀腺乳頭癌K1細胞生長抑制率，結果表明在同一作用時間條件下，金蓮花總黃酮對K1細胞的抑制率呈劑量依賴性，而同一濃度條件下隨著金蓮花總黃酮作用時間的延長，對K1細胞增殖的抑制效果呈逐漸加強趨勢，有效的驗證了金蓮花總黃酮在體外抑制甲狀腺乳頭癌細胞增殖的效果。

三葉因子家族(trefoil Factor Family，TFF)是由三個成員(TFF1、TFF2、TFF3)組成，它們蛋白質結構中具有同源的P結構域，即由6個高度保守的半胱氨酸殘基形成的3個分子內的二硫鍵使整個肽鏈扭曲形成三葉狀結構，因此它們具有耐熱、抵抗蛋白酶的作用，三葉因子在胃腸道黏膜中分布較多，能夠促進細胞增殖、遷移，是重要的黏膜保護因子［8］。TFF3定位于人21號染色體［5］，是近幾年發現的與各種類型惡性腫瘤的發展關系較為密切的因子之一，在惡性轉化的細胞中其促增殖、促分裂、促遷移的作用促進了細胞的轉化，腫瘤的發生、發展，在腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲、血管生成等方面發揮作用［9］。Kannan等在對TFF3與乳腺癌細胞抗雌激素抵抗的關系研究中發現，外源性轉染TFF3能促進乳腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲、克隆形成，而通過RNA干擾抑制TFF3表達能減少腫瘤細胞的數量及克隆形成的數量，TFF3對腫瘤細胞的影響是通過Bcl-2細胞凋亡途徑進行調節的［10］。本課題組前期對TFF3在甲狀腺乳頭癌組織中表達的研究發現TFF3蛋白和mRNA高表達率與甲狀腺乳頭癌TNM分期和淋巴結轉移有關，可作為診斷PTC的參考指標［4］。

本研究從體外實驗角度進一步檢測了不同濃度金蓮花總黃酮對K1細胞TFF3的表達變化的影響，結果表明隨著金蓮花總黃酮濃度升高K1細胞增殖率降低，TFF3蛋白及mRNA水平也隨之下降，從體外實驗證明了TFF3與甲狀腺乳頭癌細胞增殖關系密切，但是仍需要進一步驗證是否是因為金蓮花總黃酮能夠抑制TFF3表達從而導致細胞增殖下降。

參考文獻

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