北京家族結核分枝桿菌鑒定方法的研究進展

郭立娟 黃海榮 高飛 王桂榮

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·綜述·

北京家族結核分枝桿菌鑒定方法的研究進展

郭立娟 黃海榮 高飛 王桂榮

結核病仍是嚴重威脅人類健康的全球公共衛生問題之一。北京家族結核分枝桿菌是我國大部分地區流行的主要菌株。作者論述了插入序列IS6110-限制性片段長度多態性(IS6110-RFLP)、間隔區寡核苷酸分型(Spoligotyping)、長序列多態性(LSP)以及單核苷酸多態性(SNP)等多種北京家族結核分枝桿菌分型技術，并討論了各技術的優缺點，以便對北京家族結核分枝桿菌的鑒定提供可靠依據。

分枝桿菌，結核； 基因型

結核病(tuberculosis, TB)是伴隨人類歷史最長的疾病之一，也是全球由單一致病菌導致死亡人數最多的疾病，已成為全球重大公共衛生問題和社會問題。我國是全球22個結核病高負擔國家之一，結核病患者例數僅次于印度，居世界第二位[1]；我國也是全球27個耐多藥結核病(multiple drug resistant tuberculosis, MDR-TB) 高負擔國家之一。因此，我國結核病的防治工作任重道遠。結核分枝桿菌北京家族是van Soolingen 等[2]1995年首次發現并報道的，它是利用插入序列IS6110-限制性片段長度多態性(IS6110-RFLP)和間隔區寡核苷酸分型(Spoligotyping)方法對中國北京地區結核分枝桿菌進行分型研究，發現超過85%的菌株均屬于這個家族，故命名為北京家族。這些菌株具有高度相似的IS6110酶切片段多態性圖譜，Spoligotyping分型顯示這類菌株缺失了1～34個間隔區。隨后，在東亞的其他國家也發現有很高的流行。早期在美國廣泛傳播的耐多藥菌株W菌株根據Spoligotyping型別，也被鑒定為北京家族菌株，而北京家族菌株因此又被稱為“W/Beijing菌株”。近年來，許多對結核分枝桿菌的研究中，發現北京基因型菌株是一簇基因型相似的菌株的集合，統稱為“北京基因型家族株”，即北京家族。

研究顯示，根據不同的基因特征，可將北京家族進一步分為許多亞系，依此區分不同的北京家族株成員。從而深入地了解了北京家族的起源及分子進化。基因大片段多態性(LSP)分析有其特定的優勢，并已運用到眾多研究中。LSP一般是由基因缺失和重排所致，通常是不可逆的唯一事件，可作為Mtb基因分型及構建系統進化史的分子標志。Brosch等[3]發現大多數缺失并不是一件獨特事件的結果，而是一系列缺失事件留下的痕跡，其在追蹤傳播中是非常有效的手段，目前最常用的片段引物主要有氨基末端片段(N-terminal fragment，NTF)、差異區域(region of difference,RD)105、RD181、RD150、RD142[4-5]。全球的北京家族可根據RD181、RD150、RD142等3個大片段缺失進一步劃分為4個亞型。由于RD142和RD150在多個地區的北京家族菌株中多態性很低甚至沒有多態性，這3個長片段多態性(large sequence polymorphism，LSP)位點并不能有效地研究不同地區北京家族菌株的群體結構。劉彬彬[6]在對290例北京家族結核分枝桿菌的研究中，通過RD105、RD181和NTF位點的鑒定，北京家族結核分枝桿菌主要表現為4個亞群，最大的一個亞群基因型特征表現為RD105和RD181缺失，并且為現代型。這提示，在北京家族的進化中，現代型北京家族并且RD105、RD181缺失，可能是主導進化前進過程的一個重要的分支，可將RD181缺失可作為探討進化進程的一個關鍵信號。這需要在以后的研究中對其進行更深入的研究。另外，根據RD181與NTF區域的插入有無，依此區分古老型與現代型北京家族有一定的區別。

最新研究發現，北京家族菌株已蔓延全球各個地理區域，亞洲最高達44.7%，歐洲和非洲分別為27.9%和12.5%，美洲最低(8.9%)[7]。大量的臨床和流行病學研究發現，北京家族結核分枝桿菌可能與耐多藥[8-9]、高致病性有關，從而導致傳播[10]和感染活動性疾病的概率增加[11]，其已達到全球分離結核分枝桿菌菌株的13%，全世界有1/3的結核分枝桿菌由北京家族結核分枝桿菌引起，其已成為世界第二大流行的結核分枝桿菌菌株；它是遺傳上高度保守，具有在人群中引起發病的遺傳學優勢，其在世界范圍內的廣泛傳播，對公共衛生構成潛在威脅。因此，研究快速簡單的檢測北京家族結核分枝桿菌的方法是很有必要的。目前，應用較多的主要包括Spoligotyping、IS6110-RFLP、可變串聯重復序列(VNTR)、LSP、單核苷酸多態性(SNP)等。利用這些方法可將北京家族結核分枝桿菌分為不同的亞型，如：Mokrousou等[12-13]依據北京菌株基因組NTF區域IS6110插入序列的多態性而將其分為古老和現代2個亞型；Luo等[14]采用8個SNP位點結合VNTR-15的復合分型方法。首先將北京譜系Mtb分為最近共組年代不同的8個亞譜系，在此基礎上，再行VNTR-15基因分型；Schurch等[15]也推出了51個SNP位點，將北京譜系結核分枝桿菌分為現代和古代2個亞譜系。這些工作均為深入研究北京家族結核分枝桿菌的流行特征奠定了基礎。筆者對北京家族結核分枝桿菌的鑒定方法及其研究進展綜述如下。

一、 IS6110-RFLP技術

IS6110-RFLP是將插入序列IS6110與限制性片段長度多態性技術相結合的一種基因分型技術。IS6110插入序列是由Thierry等[16]于1990年最先發現并報道的，其全長1355 bp，隸屬于IS3家族，并且只存在于結核分枝桿菌基因組中。這種插入序列廣泛分布于結核分枝桿菌的基因組中，在不同的臨床分離株中其重復次數也比較寬泛，為0～26個重復[17-18]。根據IS6110在不同菌株中的數目和位置不同，從而進行基因分型。

1993年，van Embden等[19]介紹了IS6110-RFLP分型法的標準操作方法，現已廣泛應用于結核病分子流行病學的研究領域中。具體方法是首先提取結核分枝桿菌全基因組 DNA，然后利用限制性內切酶PuvII 在相應的 IS6110 酶切位點進行酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離酶切后的 DNA 片段，經Southern Blotting(DNA印記法)將分離后的 DNA 片段轉印到尼龍膜上，與標記的特異性DNA探針進行雜交顯色，最終于尼龍膜上形成特異性的DNA圖譜，即所謂的“DNA指紋”。該方法分辨率高、具有很強的菌株鑒別能力，被國際上推為結核分枝桿菌基因分型技術的“金標準”，至今仍是實驗室研究熱點之一。例如，Roychowdhury等[20]在對1377株結核分枝桿菌進行以IS6110為單位的新一代測序技術 (next-generation sequencing，NGS)分析時發現，這些菌株包括了全球7大譜系菌株，并且發現特定的譜系中IS6110的拷貝數和插入區域均是保守的，并且根據IS6110在不同譜系中的拷貝數及位置不同，可作為譜系鑒定的進化標志。

此分型方法可以用于鑒定北京家族菌株[4]，即將菌株的RFLP圖譜與19個有代表性的北京家族菌株的IS6110-RFLP圖譜(http:www.wadsworth.org/rflp/RFLP.html)相比較，如果與某一菌株譜帶相似性>80%，就可以定義為北京家族菌株。Mokrousov等[12]于2002年在對俄羅斯流行的北京家族菌株研究中發現，可根據基因組NTF區域IS6110插入多態性分為N和NTF∶IS6110兩型，N型在NTF區無IS6110插入序列，反映了祖先菌株在該位點的狀態，所以又被稱為“古老型”北京家族菌株；NTF∶IS6110型則在該區域都存在1個或2個IS6110轉座子序列，所以又被稱為“現代型”北京家族菌株[12-13]。通過比較發現，“現代型”北京家族菌株的IS6110 RFLP圖譜與早期Van Soolingen等[2]在北京地區鑒定的北京菌株及與在美國流行的W菌株的RFLP圖譜有很高的相似度(80%左右)；而“古老型”北京家族菌株間的RFLP圖譜則存在較大差異，其與“現代型”北京家族菌株RFLP圖譜的差異也較大。這說明“古老型”北京家族菌株間遺傳差異較大，而“現代型”北京家族菌株間則有極高的遺傳相似性。

對于已有RFLP圖譜的菌株，可以利用IS6110-RFLP鑒定方法進行回顧性研究，但由于操作繁瑣，這種方法并不適用于大批量快速檢測。因此，在實驗室研究中并不常規應用此方法來進行北京家族菌株的鑒定。

二、Spoligotyping技術

Spoligotyping技術是基于結核分枝桿菌基因組中的直接重復(direct repeats，DR)序列建立起來的基因分型技術。DR序列存在于所有結核分枝桿菌的基因組中，該序列包括多個36 bp的保守DNA序列和多個特異的34～41 bp的間隔序列。由于不同的結核分枝桿菌DR序列中特異性間隔序列的個數及位置不同，通過對間隔序列進行檢測即可將不同的結核分枝桿菌區分開來[21]。1997年Kamerbeek等[22]設計了一種獨特的PCR方法，該方法首先采用PCR擴增結核分枝桿菌的DR序列，然后與固定在膜上的43條間隔序列特異性探針進行雜交，再通過增強化學發光法(ECL)檢測[23]，得到較為特異的結果。結果判讀雜交陽性即間隔區存在，用“1”表示，陰性即間隔區缺失，用“0”表示，這樣每間隔區的檢測結果就獲得0或1的數字編碼，然后用BioNumerics軟件進行結果分析。通過Spoligotyping可將全球流行的結核分枝桿菌分為60多個主要的家族以及千百種無法進行歸類的新基因型。目前國際上已建有Spoligotyping數據庫(SploDB4)，該數據庫共收錄了世界范圍內122個國家的 39 295株結核分枝桿菌分離株的Spoligotyping圖譜[24]。

1995年van Soolingen 等[2]采用Spoligotyping技術進行結核分枝桿菌基因分型的研究時發現，中國北京及其周邊地區存在一大群具有顯著相似遺傳特征的結核分枝桿菌，主要特征是43個寡核苷酸探針中1至34位呈陰性反應，即命名為北京家族菌株。且根據Spoligotyping特征性圖譜分析，可將北京家族菌株分為“典型”(43個特征性間隔序列中1～34位缺失，35～43位9個間隔序列存在)和“非典型”(不完全與第35～43間隔區雜交，雜交區的數目少于9個)兩大類。近年來，利用Spoligotyping進行基因分型的研究很多。例如，Flores-Trevio等[25]利用Spoligotyping對墨西哥哈里斯科州的68株結核分枝桿菌進行基因多態性研究時，發現了一個罕見的與高耐藥有關的北京家族基因型(SIT406)，這是在拉丁美洲的首次發現；Wang等[26]利用Spoligotyping對來自青海的251株結核分枝桿菌進行基因分型時，發現菌株呈現基因多態性。經聚類分析，可被分為2大基因群，即北京家族菌株(73.7%)和非北京家族菌株(26.3%)。但應用該分型技術不能區分不同的北京基因型菌株，且該方法操作復雜、耗時較長，需要多種儀器設備，不適合基層實驗室及大規模的推廣應用。

三、LSP技術

LSP是基于結核分枝桿菌基因組DNA中的RD而建立的結核分枝桿菌譜系鑒定技術。LSP一般是由基因缺失和重排所致，并且這些RD缺失一旦發生，大部分會穩定遺傳到子代菌株基因組中，因此，可作為結核分枝桿菌基因分型及構建系統進化史的分子標志。通過該技術可將全球的結核分枝桿菌分為6大譜系[27]，即環印度洋系(L1)、東亞譜系(L2)、東非-印度譜系(L3)、歐美譜系(L4)、西非-1系(L5)、西非-2系(L6)，北京家族隸屬于東亞譜系。且每個譜系結核分枝桿菌均與對應的地理人群存在著一定聯系[28-30]。此外，Tessema等[31]在對來自埃塞俄比亞西北部的244株結核分枝桿菌進行VNTR和Spoligotyping研究時，發現了一個新的譜系，定義為L7。研究發現，根據TbD1缺失與否可將6大譜系分為古老與現代菌株，即環印度洋系、西非-1系、西非-2系(L1、L5、L6)，由于存在TbD1，被認為是古老菌株，而其他譜系由于缺失TbD1則被認為是現代菌株[3]。LSP 與 Spoligotyping 在鑒定結核分枝桿菌主要譜系(或家族)上具有一定程度的一致性，如經 LSP 鑒定的東亞譜系與經 Spoligotyping 鑒定的北京家族結核分枝桿菌呈高度一致，歐美譜系與 T 家族、S家族、X 家族、Haarlem、LAM 家族相一致，東非-印度譜系與 CAS 家族相一致，環印度洋譜系與 EAI 家族相一致[32]。近年來，利用LSP技術對結核分枝桿菌的研究越來越多。例如，Faksri等[33]利用LSP技術對來自泰國的256株結核分枝桿菌進行譜系分類，可得到環印度洋系譜系(70%)、北京譜系(23%)和歐美譜系(7%)三大譜系，并且發現北京家族譜系與耐藥和低齡化相關。LSP采用普通PCR 即可完成基本操作(個別RD片段需要進行測序等輔助檢查技術)，針對某一特定RD片段，在其序列兩端設計合成引物，PCR擴增得到相應產物片段，電泳鑒定產物片段長度，若該RD片段缺失，則產物片段相對較短，即可鑒定為某一譜系結核分枝桿菌。

2005年，Tsolaki等[5]在比較結核分枝桿菌標準株H37Rv與北京家族菌株LSP的差異過程中發現，RD105在所有H37Rv菌株中都存在，而在所有北京家族菌株中全部缺失，提出了RD105缺失基因可以作為“北京家族”菌株鑒定的一個非常有價值的分子標記。研究表明，RD105缺失基因檢測法對北京家族菌株的鑒定結果與金標準Spoligotyping基本一致，敏感度和特異度高達100%，且該方法操作簡便、快速、費用低廉、結果準確可靠，逐漸成為對北京家族菌株進行鑒定的首選篩選方法[34]。另外，全球的北京家族菌株可被另外3個大片段缺失(RD181、RD142、RD150)進一步劃分為4個亞型。其中，根據RD181的缺失與否，可將北京家族菌株分為“古老型”和“現代型”。但由于RD142和RD150在多個地區北京家族菌株中的多態性很低甚至沒有多態性，這3個LSP位點并不能有效地研究不同地區北京家族菌株的群體結構[35]。

四、單核苷酸多態性(single nucleotide polyrnorphism，SNP)技術

SNP技術主要是指基因組水平上由單個核苷酸變異引起的基因組DNA序列多態性，這種多態性包括單個堿基的轉換、顛換、插入和缺失等4種形式，但研究中通常認為SNP僅包括轉換和顛換兩種形式。它可分為同義SNP和非同義SNP兩類，這些SNP位點與微衛星等重復序列多態性相比，具有如下優點：(1)位點豐富：SNP位點幾乎遍及整個基因組，它是人類可遺傳的變異中最常見的一種；(2)遺傳穩定：與其他重復序列多態性標記相比，具有更高的遺傳穩定性；(3)疾病相關性：SNP突變可影響蛋白質結構或表達，從而引起表型變異、耐藥、疾病易感性等。因此，SNP可被用于結核分枝桿菌菌種鑒定、進化分析，以及疾病相關基因等方面的研究。

SNP有多種鑒定方法，但依據其基本原理可分為兩大類：一類是DNA測序相關方法，主要有全基因組測序和目的基因片段測序兩種；另一類是基于PCR擴增的非DNA測序方法，如實時定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)、PCR限制性片段長度多態性(PCR-RLFP)、PCR單鏈構象多態性(PCR-SSCP)、基因芯片(基因探針)檢測等。北京家族結核分枝桿菌由于其在致病性、耐藥及傳播方面的獨特性，引起了人們利用SNP位點對其進行研究的興趣。Homolka等[36]研究發現，Rv2629等位基因中的A191C突變是北京基因型的生物學標志。隨后，Alonso等[37]利用該SNP標志建立了一種與RT-PCR結合的高分辨率熔解(high-resolution melting)實驗，可快速區分北京家族與非北京家族的菌株。另外，Jiang等[38]利用SNP技術在對來自中國的180株結核分枝桿菌人類 T細胞表位中Ag85抗原復合體分析時發現，Ag85B中的C714A基因位點可能是北京家族系統進化的非常有價值的分子標記。此外，Mestre等[39]通過復制、重組、修復相關3R基因(replication，recombination和 repair)的單核苷酸多態性位點分型，可將我國的北京菌株進一步分為7種亞型，并且發現Bmyc10亞型在群體中占主導地位，約占所有北京菌株的80%。通過比較發現，Bmyc10亞型與根據NTF區域差異定義的“現代北京家族”本質上是同一類菌株，但SNP分型對北京家族菌株的定義更為細致。此外，羅濤[40]從我國11省份收集并鑒定的1385株北京菌株3R基因的8個 SNP位點進行分型，這些菌株共被分為8個亞型，并且根據菌株在mutT2基因58號密碼子的突變情況，Bmyc10、Bmyc13及Bmyc210屬于“現代型”北京家族菌株，而Bmyc2、Bmyc6、Bmyc4、Bmyc25及Bmyc26屬“古老型”北京家族菌株。并且和VNTR等基因分型相比，SNP具有可準確定義菌株進化地位的優勢。

五、分枝桿菌散在重復單位-數目可變串聯重復序列(Mycobacterium interspersed repeats units-variable number of tandem repeats，MIRU-VNTR)技術

MIRU-VNTR技術是基于結核分枝桿菌基因組中的 VNTR 位點而建立起來的結核分枝桿菌基因分型方法。VNTR 又稱“小衛星 DNA” (mini-satellite DNA)，是一種重復 DNA 小序列，每個特定的 VNTR 位點由兩部分組成，即中間特異的“核心區”和兩側保守的“側翼區”。核心區含有至少 1 個以上稱之為“重復單位”(repeat unit)、并以串聯形式存在的 DNA 短序列，一般該重復單位的堿基序列不變，但在不同的結核分枝桿菌中該重復序列串聯在一起的數目是可變的[41]。MIRU-VNTR 就是針對結核分枝桿菌基因組 DNA 中的多個 VNTR 位點，對其進行組合，通過對相應位點進行重復單位數目的計算，實現對不同結核分枝桿菌的基因分型。該方法的基本原理是基于 PCR 的擴增方法， 挑選適當的 VNTR 位點，PCR 對該位點進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR 產物大小，并根據已知的該位點“重復單位”大小及兩側的保守側翼區(flank region)大小對該位點進行重復單位個數的計算，相應結果用數字表示。對多個 MIRU-VNTR 位點進行組合分析，最終得到一組由不同數字組成的 MIRU-VNTR 基因型，從而實現了不同結核分枝桿菌的基因分型[42]。該方法較 IS6110-RFLP 操作簡便，對 DNA含量及質量要求較低，不需預先培養結核分枝桿菌，也不需結核分枝桿菌的全基因組 DNA；結果以數字化形式表現，便于分析及不同實驗室之間進行比較；分辨率略低于 IS6110-RFLP，但明顯高于 Spoligotyping，因此受到了結核病分子流行病學研究領域的廣泛重視。

但VNTR分型法與北京家族結核分枝桿菌識別的關系尚不清楚。雖然 15 位點和 24 位點 MIRU-VNTR 組合在結核病分子流行病學研究領域發揮了重要的作用，但是大量的研究表明，對于北京家族結核分枝桿菌高流行的地區(如中國)來說，這兩種組合并不是最佳的基因分型位點組合[43-44]，主要是由于北京家族結核分枝桿菌菌株間的遺傳相似性較高的原因[14]。因此，Iwamoto 等[45]對北京家族結核分枝桿菌進行深入研究，組建了一套 18 位點 MIRU-VNTR 組合用于對北京家族結核分枝桿菌進行基因分型。Murase 等[46]重新組合了12 個 MIRU-VNTR 位點，發現該 12 位點 MIRU-VNTR 對北京家族結核分枝桿菌的分辨能力優于標準 15 位點MIRU-VNTR，接近 24 位點 MIRU-VNTR。Luo 等[47]為推行出一套最適合中國地區流行的結核分枝桿菌基因分型的 MIRU-VNTR 位點組合，對收集自中國6個省的1362 株結核分枝桿菌進行了 25 個 MIRU-VNTR 位點的分辨能力的評價，最終組建出適合于我國結核分枝桿菌基因分型的 9 個 MIRU-VNTR 位點組合，以及用于進一步區分成簇菌株的 3 個 VNTR高變位點。劉彬彬[6]利用15位點對北京家族菌株的研究中，發現MLVA分型在北京家族進化的探討中也可起到一定的標識作用，并篩選出ETRD、MIRU26、Mtub21和Mtub30這4個位點，可以作為提供北京家族菌株系統進化的信號；金嘉琳等[48]在利用12位點VNTR進行北京家族菌株進行分型中，發現在北京家族菌株中分辨率最高的是MIRU26位點，最低的為ETR-B位點；所以針對特定地區和人群，應選取分辨率較高的VNTR位點進行北京家族的微進化研究，從而能為北京家族菌株分子流行病學框架的構建、菌株進化研究和臨床菌株的基因型分析提供幫助。

六、小結

結核病分子流行病學研究是集分子生物學、臨床醫學及流行病學幾種學科的聯合應用，它從基因水平研究結核病的病原分子特征、遺傳變異機制、耐藥機制、人群中傳播規律及危險因素等。分子流行病學的核心是分子分型技術，它能克服傳統流行病學不足，對結核病暴發流行時追蹤傳染源、檢測結核病的傳播、區別內外源性感染、多克隆或單克隆感染、識別耐藥菌株感染流行，以及分析某一地區流行的結核分枝桿菌的群結構特征等方面的研究都具有十分重要的意義[49]。

在對北京家族結核分枝桿菌進行鑒定的各種分型方法中，IS6110-RFLP、Spoligotyping和VNTR技術是國際上進行結核病流行病學研究最常用的方法，并且在結核病的防控中發揮了重要作用，目前都已有標準操作方法；LSP和SNP是新興的分子分型技術，隨著對這些分型技術的深入研究，北京家族結核分枝桿菌的鑒定會更加簡便、快速和細致。

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(本文編輯：范永德)

Progress in identification of Beijing familyMycobacteriumtuberculosis

GUOLi-juan*,HUANGHai-rong,GAOFei,WANGGui-rong.

*InnerMongoliamedicaluniversitygraduateschool,Hohhot010059，China

WANGGui-rong，Email：276761010@qq.com；GAOFei,Email:gaofeiwho@163.com

Tuberculosis is still a big public health problem worldwide. Tuberculosis is mainly caused by Beijing familyMycobacteriumtuberculosisin China. This paper discussed the progress of several genotyping methods including insertion sequence 6110-restricted fragment longevity polymorphism (IS6110-RFLP), spacer oligonucleotide typing (Spoligotyping), large sequence polymorphism (LSP) and single nucleotide poly- morphism (SNP) in identification of Beijing familyMycobacteriumtuberculosis, which will provide a reliable basis for selecting genotyping methods to identify Beijing family strains.

Mycobacteriumtuberculosis; Geneotyper

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.02.015

北京市衛生系統高層次衛生技術人才培養項目(2014-3-084)

010059 呼和浩特,內蒙古醫科大學研究生學院(郭立娟)；首都醫科大學附屬北京胸科醫院 北京市結核病胸部腫瘤研究所 國家結核病臨床實驗室 北京市耐藥結核病研究重點實驗室(黃海榮、王桂榮)；內蒙古自治區第四醫院(高飛)

王桂榮，Email：276761010@qq.com； 高飛，Email：gaofeiwho@163.com

2015-09-15)