PAK5和MDRl/P-gp在卵巢癌細胞紫杉醇耐藥中的表達和臨床意義

鄒競慧　李笛悠　張　萍★

PAK5和MDRl/P-gp在卵巢癌細胞紫杉醇耐藥中的表達和臨床意義

鄒競慧李笛悠張萍★

卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，其病死率居女性生殖系統腫瘤首位，由于大多數卵巢癌發病隱匿，且缺乏準確有效的早期診斷方法。目前手術聯合化療的綜合治療在一定程度上延長了晚期卵巢癌患者的生存時間，但多數患者在18～24個月后復發，其5年生存率＜30%。腫瘤細胞減滅術加以鉑類和紫杉醇為基礎的聯合化療已成為當前卵巢癌的標準治療手段。雖然多數患者初始反應敏感，甚至可達到近期緩解，但是由于化療耐藥的產生，限制了化療藥物的抗腫瘤效應，嚴重影響了卵巢癌患者的遠期療效和總體生存率。以往針對耐藥機制進行了一些耐藥逆轉的研究。但是大多數研究結果均未顯示上述方法的有效性。因此，深入探索與化療耐藥相關的細胞及分子生物學機制，尋找有效干預靶點，成為改善化療效果和解決耐藥問題的關鍵。

1　卵巢癌細胞耐藥機制

紫杉醇是卵巢癌的一線化療藥物，關于卵巢癌耐藥機制，傳統假說認為，腫瘤細胞在長期進化過程中發生獲得性體細胞突變或表基因改變導致耐藥［1］。目前更多的研究認為卵巢癌腫瘤細胞特異性耐藥機制主要是：（1）細胞內有效藥物濃度降低。多藥耐藥蛋白（MRP）、膜轉運蛋白P糖蛋白（P-gp）、肺耐藥蛋白（LRP）等通過藥物泵進、泵出平衡的改變導致細胞內有效藥物濃度降低，誘發卵巢癌細胞耐藥［1］。最近，Penson等［2］發現P-gp表達與卵巢癌復發患者對紫杉醇的再次化療的緩解率呈負相關。Koji Matsuo等［3］實驗證明MDR-1與卵巢癌晚期腦轉移高度相關，具體機制目前尚不清楚。H Chen等［4］發現MDR-1與uPA、CD44在ECO耐藥細胞中共表達，并且隨著ECO惡性程度增強，表達量增加。另外，谷胱甘肽s轉移酶（GST）使細胞內游離藥物與谷胱甘肽結合而失活也誘導耐藥，但卵巢癌患者GST表達與化療緩解率及預后的關系目前尚未明確。該系統可促進體內有毒物質的排出，防止有毒化合物與DNA、RNA和蛋白質等生物大分子物質的結合，其中研究較多的是谷胱甘肽s轉移酶（GST），GST水平升高與紫杉醇MDR有關。（2）DNA的損傷修復異常。Gifford等［5］發現卵巢癌復發的患者血漿中DNA-MLHl甲基化的比率明顯升高，這與其血漿DNA微衛星不穩定性相關，導致DNA的損傷修復異常。還有研究表明乳腺癌易感基因（BRCAl）也在DNA損傷修復過程中發揮重要作用，目前認為其功能缺失可能降低紡錘體抑制劑的作用，增加了細胞對DNA損傷性化療藥的敏感性［6］。（3）藥物作用靶點改變。研究發現紫杉醇介導微管蛋白聚合的β微管蛋白基因突變，微管蛋白亞型改變表達和微管蛋白濃度降低，破壞了細胞有絲分裂期和分裂間期功能所必需的微管系統動態再生，可能導致紫杉醇耐藥。具體機制目前尚不清楚［1］。（4）藥物靶分子下游效應信號傳導通路異常。由于多數腫瘤對不同藥物及放療均存在交叉耐藥性，近年來研究的重點已從藥物特異性機制轉移到藥物靶分子的下游效應途徑及共同的凋亡信號。一些癌基因、抑癌基因及凋亡調控分子參與這些效應途徑。近來研究發現紫杉醇可靶激活巨噬細胞，導致腫瘤壞死因子（TNF-a）受體的減少及TNF-a釋放，作用于細胞凋亡受體途徑的Fas/Fas-L通路，或激活天冬氨酸蛋白酶家族（caspases）抑制細胞凋亡，誘發耐藥［7］。體外研究還發現，抗凋亡蛋白Bcl-2、IAP、熱休克蛋白（HSPT0、rISP90）等表達上調，凋亡前蛋白BAX表達下調降低了卵巢癌細胞對紫杉醇的敏感性，一些臨床研究也支持Bcl-2和IAP參與耐藥，因此Bcl-2高表達可能是卵巢癌患者預后良好的標志，目前已有利用Bcl-2反義核酸作為化療增敏劑的臨床研究［8］。（5）影響細胞膜形態及功能。紫杉醇可以通過影響細胞骨架中的肌球蛋白和微管形成，促進細胞骨架重排，抑制細胞胞膜偽足形成，從而影響腫瘤細胞的趨化作用及遠處遷移［9，10］。（6）其他如腫瘤微環境的改變［11］。腫瘤的發生和轉移與腫瘤細胞所處的內外環境有著密切關系。腫瘤微環境不僅包括腫瘤所在組織的結構、功能和代謝，而且亦與腫瘤細胞自身的（核和胞質）內在環境有關。腫瘤細胞可以通過自分泌和旁分泌，改變和維持自身生存和發展的條件，促進腫瘤的生長和發展。全身和局部組織亦可通過代謝、分泌、免疫、結構和功能的改變，限制和影響腫瘤的發生和發展。一般認為與腫瘤組織內新生血管結構和功能嚴重缺陷造成組織內間隙液體壓升高、低氧環境和酸中毒等因素有關，這種異常的微環境形成的機制目前尚未完全闡明。某些腫瘤細胞系對紫杉醇的敏感性還依賴于紡錘體檢查點的功能狀態，在臨床耐藥中的作用仍需進一步研究［12］。

2　腫瘤多藥耐藥MDRl及其所編碼的P-gp機制

目前卵巢癌紫杉醇耐藥機制中，研究最多最重要的是腫瘤細胞對紫杉醇產生多藥耐藥（Multidrug resistance，MDR）。MDR指腫瘤細胞對結構和作用機制不相同的藥物均產生耐藥的現象，與多藥耐藥基因MDRl及（或）多藥耐藥相關蛋白（MRP）基因過度表達有關。人類MDR基因家族是由MDR1基因和MDR3基因組成，并編碼各自的P糖蛋白（P-gp），其中MDRl及其所編碼的細胞膜P糖蛋白（P-gp）表達增加介導的卵巢癌介導的紫杉醇耐藥中最為常見。 P-gp為三磷酸腺苷（ATP）結合轉運蛋白（ATP binding cassette，ABC）家族成員之一，具有ATP酶活性，是一種分子量約為170KD跨膜運輸蛋白，由1280個氨基酸殘基組成，嵌插在細胞的漿膜上形成通道，細胞內包括疏水性化療藥物在內的中性或帶正電荷的疏水性分子可以通過該通道將相同的天然藥物如紫杉醇、環孢菌素等藥物排出細胞外，降低細胞內的有效藥物濃度，從而阻礙化療藥物作用的發揮而產生耐藥［13］。腫瘤藥誘導細胞MDR1表達可能是導致卵巢癌治療失敗的主要原因［14］。最近還有研究表明腫瘤MDR形成造成腫瘤的化療不敏感，可能引起腫瘤的侵襲性和轉移性改變，但具體機制尚未闡述［15］。

Gottesman等［16］在早期的研究中證明P-gp是由PKC磷酸化的，磷酸化后的P-gp具有跨膜轉運功能，并且這種磷酸化過程可被verapamiI 抑制，而被PKC激活劑增強。PKC是一種普遍存在的磷脂依賴性酶，與細胞增殖分化，凋亡的信號轉導密切相關，同時參與了MDR形成過程的調控［17］。

3　PAK5在卵巢癌細胞紫杉醇耐藥中的表達和功能

3.1PAK5的特點和生理功能 PAK5為p21活化的激酶（PAKs）家族中新近發現的成員，PAKs是一類高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過與Rac和Cdc42結合而激活發揮作用。作為小G蛋白Rho家族的下游靶蛋白，PAK5可被生長因子及其他胞外信號活化。近來研究表明PAK5在神經源性腫瘤、胃腸癌、骨肉瘤、乳腺癌及卵巢上皮癌等組織細胞中過度表達。PAK5是多種信號傳導通路的核心分子，當PAK5激活后，活化下游的效應蛋白，如MAPK、JNK等引起生物學功能的改變，如細胞的異常增殖，細胞的粘附遷移和細胞抗凋亡等［18］。Cotteret等［19］發現PAK5定位于細胞線粒體時，通過直接磷酸化BAD蛋白第112位絲氨酸（Bad Serl12）抑制細胞凋亡，當PAK5定位于細胞核時，不能有效的磷酸化BAD，不能抑制細胞凋亡。另外，PAK5也能通過AKT途徑間接磷酸化BAD蛋白第136位絲氨酸（Bad Serl36），抑制細胞凋亡［20］。

3.2PAK5在腫瘤組織中的表達和功能 近來研究表明，在腦膠質瘤中，PAK5可與細胞骨架中的肌球蛋白和微管結合，促進微管形成，影響細胞運動［21］。PAK5還可與細胞外基質受體結合，激活整合素，促進粘附結構蛋白及小GTPaseRac、Cdc42在細胞膜上簇集粘附，促進細胞骨架重排，增強細胞極性化，刺激細胞胞膜形成絲狀偽足及片狀偽足［22］。Wang等［23］發現PAK5通過直接磷酸化Bad Ser112位點和通過AKT間接磷酸化Bad Serl36，顯著降低Bad與Bcl-2或Bcl-x（L）的相互作用，增加Bad與14-3-3蛋白的相互作用，抑制結腸癌細胞凋亡。而Gu等［24］發現PAK5通過CDK2， CDC25A和細胞周期D1阻滯細G（0）/G（1）期，抑制胃癌細胞增殖。在骨肉瘤組織中，PAK5通過磷酸化P-BAD激活Caspase-3，Caspase-9抑制細胞凋亡［25］。Taneja等［26］證明PAK5是乳腺癌細胞凋亡抑制因子，抑制PAK5基因表達可上調p21蛋白的表達，下調CyclinD1蛋白，使細胞停滯在Gl期，抑制細胞增殖，同時下調凋亡相關蛋白pre-caspase8及pre-caspase3的表達，誘發細胞的凋亡。最新研究在乳腺癌細胞中，發現PAK5通過磷酸化GATA1 Ser161和Ser187抑制細胞間質鈣粘蛋白，細胞連接斷裂，促進上皮間質轉化，降低細胞間的粘附性，使乳腺癌細胞侵襲轉移明顯增強［27］。

3.3PAK5在卵巢癌細胞紫杉醇耐藥的表達和功能 Diyou等［28］證明PAK5在卵巢癌細胞中的過表達，且隨著卵巢癌惡性程度增加，PAK5表達量增高，同時PAK5促使卵巢癌發生紫杉醇耐藥。PAK5基因還可以調節卵巢癌細胞周期促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，誘發卵巢癌耐藥。PAK5基因可能通過作用于細胞骨架中的肌球蛋白和微管結合，影響細胞膜的運動形態及功能，改變了細胞的抗藥性。關于PAK5誘發卵巢癌細胞耐藥的具體機制及下游的信號傳導通路目前尚不清楚。

4　展望

綜上所述，在卵巢癌紫杉醇耐藥細胞中，P-gp和PAK5均高度表達，眾多證據表明卵巢癌耐藥機制中，多藥耐藥基因MDRl及其所編碼的細胞膜P糖蛋白（P-gp）表達增加介導的卵巢癌紫杉醇耐藥最為重要，同時發現PAK5可以通過各種信號傳導通路在惡性腫瘤組織細胞中發揮作用，如細胞的異常增殖，細胞的粘附遷移和細胞抗凋亡等。最新研究確定PAK5是卵巢癌紫杉醇耐藥的核心調節靶點之一，接下來進一步研究PAK5基因的分子生物學作用機制，PAK5是否通過介導MDRl/P-gp的表達參與卵巢癌細胞紫杉醇耐藥，這為臨床上干預有效的信號傳導環節及研發新型的腫瘤抑制性藥物提供新的思路。

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上海市衛生局課題項目（20144Y0144）

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