植物組培技術常見問題及其預防措施

任輝麗

摘 要 主要對植物組培技術中常見問題如污染、材料褐變和玻璃化現象等方面進行闡述，并在此基礎上提出相應對策。

關鍵詞 植物組織培養技術；常見問題；預防措施

中圖分類號：S722 文獻標志碼：B 文章編號：1673-890X（2015）36-0-02

植物組織培養技術作為當代生物科學中最有生命力的一門學科，應用廣泛，在農業、林業、工業和醫藥業等行業均有涉及，且產生了巨大的經濟和社會效益，但由于組培育苗操作程序復雜，各種技術難題仍受到廣大科研工作者的困擾，如污染、材料褐變、瓶苗玻璃化等常見問題屢見不鮮，試驗組培成功的植物多樣，但利用組培規模化生產的植物并不多見，下面對該技術中常見的三大問題（污染、材料褐變和玻璃化現象）及預防措施進行闡述[1-4]。

1 污染問題

1.1 污染原因

污染是指在培養過程中，培養基或培養材料上滋生真菌、細菌等微生物，使培養材料不能正常生長和發育的現象。在實驗室及規模化生產中，組織培養中污染時有發生，造成污染的原因主要有以下幾點：培養基以及在培養過程中的各種器具滅菌不徹底；培養時外植體消毒不徹底；接種和培養環境不清潔；接種人員無菌操作不嚴格；培養容器原因，包括蓋子和封口膜等。此外，材料滅菌不徹底同樣也會造成成批接種材料被細菌污染，而且培養過程不嚴格遵守無菌操作規程也是造成細菌污染的重要原因。培養環境不清潔、超凈工作臺的過濾裝置失效、培養容器的口徑過大以及封口膜破損等主要引起真菌污染[5-9]。

1.2 污染的預防措施

1.2.1 滅菌徹底

嚴格各個環節的操作流程，特別是培養基及操作過程中的各種器具必須要嚴格滅菌。培養基滅菌有以下要求：耐高溫培養基在121～123 ℃條件下滅菌20～30 min。其次，接種用的器具除了經過高溫霉菌外，在接種的過程中，每使用1次后，都要蘸酒精在酒精燈火焰上灼燒滅菌，特別是在不慎接觸到污染物時，極易由于器具引起污染。最后，對于被污染的培養瓶和器皿要單獨浸泡，單獨清洗，有條件的滅菌后再清洗[10-14]。

1.2.2 選擇適當的外植體

要認真地選擇外植體，減少外植體上的帶菌量。一般來說，培養時，田間生長的材料帶菌會比在溫室生長材料多；從帶菌數量多少來看：多年生木本材料多于一二年生的草本材料；老的材料多于幼嫩的材料。

莖尖外植體培養時注意的是：預培養，在室內或無菌條件下進行；沖洗，用水沖洗后插入無糖的營養液；發枝，以新抽的嫩枝作為外植體；暗培養后取材，要求在無菌條件下暗培養，從抽出的徒長黃化枝條上取材。以上措施均可明顯減少污染。

1.2.3 外植體消毒

外植體上可能附著外生菌和內生菌。外生菌可以通過表面消毒方法殺滅；而內生菌生長的植物材料內部，表面消毒難以殺滅，培養一段時間后，病原菌自傷口處滋生。防治內生菌首先將欲取材的植株或枝條放在溫室或無菌培養室內預培養，再在培養液中添加一些抗生素或消毒劑。

1.2.4 環境消毒

環境消毒在降低培養污染率中尤為重要，且在高溫高濕的條件下污染率會顯著增高，需要注意到的是，必須定期進行熏蒸或噴霧消毒。各類消毒方法因人因環境而異：高錳酸鉀和甲醛熏蒸對人體有一定傷害，但是其消毒效果明顯，一般每年熏蒸2～3次。日常推薦使用的紫外線照射消毒以及臭氧消毒機消毒同樣可以有效降低污染率，而且對人體的傷害也不大。

1.2.5 嚴格無菌操作

在接種時，要嚴格無菌操作，避免人為因素造成污染。為了使超凈工作臺有效工作，防止操作區域本身帶菌，要定期對過濾器進行清洗和更換。

2 材料褐變

在植物組織培養中，由于組織中多酚氧化酶被激活，使細胞酚類物質被氧化而產生棕褐色醌類物質，從而出現了褐變這種現象。它嚴重地影響外植體的脫分化、再分化和生長，對培養過程的損失顯而易見[15-17]。

2.1 產生機理

產生的機理分為2種：非酶促褐變和酶促褐變。在植物組織培養中，由酶促褐變引起的褐變被認為是主要根源，其中引起褐變的酶有很多種，主要是由多酚氧化酶PPO、過氧化物酶POD、苯丙氨酸解氨酶等組成。在初次培養和繼代培養過程中，經過測定試管苗的褐變程度和PPO的活性，有研究表明PPO活性與褐變程度的高低具有顯著的相關性。

2.2 抑制措施

在抑制褐變的方法上，目前已經有了諸多有效的處理措施，主要從以下方面來展開：去氧化；抑制特異性酶；通過有效手段控制或減少中間產物的產生。具體措施如下。

2.2.1 預處理措施

外植體材料的預處理：沖洗外植體，在2～5 ℃的低溫下處理12～24 h，升汞或酒精消毒，取外植體浸泡10 min后培養（浸泡時采用0.1%漂白粉溶液）。

2.2.2 取材措施

在外植體的取材過程中需要注意以下幾點：褐變程度較小的品種和部位更適宜；幼苗褐變程度低；夏季材料褐變趨向性更明顯；早春和秋季的材料更合適取材。

2.2.3 培養基的質量控制

培養基的狀態和類型與褐變程度具有明顯的相關性，因此，更要注意對培養基的成分的質量控制，嚴格把關，減少污染率。

2.2.4 抑制劑和吸附劑的選擇

在長期的組織培養過程中，目前已經廣泛的使用了褐變抑制劑及部分吸附劑，目的是最大程度的降低褐變程度，以降低不必要的經濟損失。由此，可以在培養基中加入PPO抑制劑以及部分抗氧化劑，如偏二亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸等。常用的吸附劑有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮PVP。

2.2.5 細胞篩選措施

為剔除易褐變的細胞，經常性進行細胞篩選在組織培養過程中是很有必要的一項措施，在外植體接種環節里，在接種后的1～2 d立即轉移，使其再次轉移到其他新鮮培養基中繼續培養，降低培養物的毒害作用，經過連續轉移（一般5～6次），褐變程度顯著下降[18]。

3 玻璃化問題

“玻璃苗”在組織培養過程中不可避免，而且在大規模培養中玻璃化問題亟待解決。

3.1 玻璃化形成的機理

植物組織培養過程中，玻璃化現象是特有的一種生理性病變，目前有關玻璃化形成機理方面的研究主要集中在水勢過高的影響，生長調節劑平衡問題和礦質元素平衡供應問題3個方面，普遍認為是培養環境中的各方面因子共同作用導致植物組織新陳代謝紊亂，進而出現“玻璃苗”。

3.2 預防措施

目前主要采取以下幾方面措施來預防玻璃化的發生。

3.2.1 外植體的選擇

優先考慮不易玻璃化的基因型及部位，且頂芽部位有助于減少玻璃苗的產生。

3.2.2 培養基成分的調整

第一，外源生長調節劑的添加很有必要。如添加IAA、GA3、ABA，可以減少玻璃苗的出現。第二，合理調整成分濃度。如降低銨態氮濃度的同時提高硝態氮含量，在預防玻璃苗的大規模生產實踐中成效顯著。第三，調整適宜瓊脂濃度。由于瓊脂雜質中的部分元素（如Ca2+、Mg2+等）含量會影響培養基中礦質元素的合理比例，因此一般瓊脂濃度不低于0.8%，并且針對條狀瓊脂會提前浸泡24 h；第四，添加有機物根皮苷、添加植物生長調節劑合成前體如ACC或添加適宜濃度的活性炭等均可有效地抑制玻璃苗形成。

3.2.3 改變培養的環境條件

光照條件：盡量采取光照培養，在適宜的光照時間內適當提高光照強度。溫度條件：根據不同材料將溫度調整在適宜范圍，一般將溫度控制在24～28℃。濕度條件：為降低培養容器內的空氣相對濕度，必要的通氣措施尤為重要，同時要注意改善氧氣供應狀況，因此使用可調節通氣的組培專用瓶可以達到良好的通氣效果。pH值：一般條件下調整pH值于7.0左右。其他條件：繼代培養每間隔4～5代，一般20 d為一個周期，培養時采用無激素的培養基，可先培養一個周期，再用1/2含量激素的培養基進行過度，過度一個周期后，再用原培養基培養。

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（責任編輯：趙中正）