甜菜屬厚皮菜SWTY-1細(xì)胞質(zhì)VNTRs多態(tài)性分析

甜菜屬厚皮菜SWTY-1細(xì)胞質(zhì)VNTRs多態(tài)性分析

劉巧紅1,羅成飛1，代翠紅1，袁肖寒2，梁乃國(guó)1，劉天驕1，史淑芝1，于歆1，呂星道2

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱150090;

2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物技術(shù)研究中心，哈爾濱150030)

摘要：利用數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列(Variable Number of Tandem Repeats，VNTRs) 微衛(wèi)星標(biāo)記方法，對(duì)重慶厚皮菜甜菜材料SWTY-1群體中100個(gè)單株的細(xì)胞質(zhì)線粒體DNA片段中TR2位點(diǎn)VNTRs片段多態(tài)性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示97個(gè)單株線粒體TR2位點(diǎn)微衛(wèi)星串聯(lián)重復(fù)序列均為3拷貝，與普通糖甜菜一致；3個(gè)單株線粒體TR2位點(diǎn)微衛(wèi)星串聯(lián)重復(fù)序列為6拷貝，發(fā)現(xiàn)甜菜屬厚皮菜細(xì)胞質(zhì)TR2位點(diǎn)VNTRs存在多態(tài)性，在該群體中發(fā)現(xiàn)了不同于甜菜栽培種新的細(xì)胞質(zhì)單株。對(duì)該群體材料100個(gè)單株的抽薹及結(jié)籽進(jìn)行觀測(cè)，結(jié)果顯示微衛(wèi)星串聯(lián)重復(fù)序列為6拷貝的變異植株中2個(gè)單株花期未抽苔開花，1株抽苔晚未形成正常種子；細(xì)胞質(zhì)TR2位點(diǎn)VNTRs片段拷貝數(shù)為3的植株中2個(gè)單株未能正常抽薹，其他植株均正常抽薹結(jié)籽。

關(guān)鍵詞：甜菜屬；細(xì)胞質(zhì)；雄不育；線粒體；分子標(biāo)記

中圖分類號(hào)：TS242.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：2014-09-16;修回日期：:2014-11-03.

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)

作者簡(jiǎn)介：?jiǎn)卧鲚x，男，在讀碩士，研究方向：通信與信號(hào)處理；E-mail：519579098@qq.com.

doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2015.01.03

Analysis for variable number of tandem repeats in cytoplasm genome of

BetavulgarisciclaSWTY-1

LIU Qiaohong1, LUO Chengfei1, DAI Cuihong1，YUAN Xiaohan2，LIANG Naiguo1,

LIU Tianjiao1, SHI Shuzhi1，YU Xin1，Lü Xingdao2

(1.SchoolofFoodScienceandEngineering,HarbinInstituteofTechnology,Harbin150090,China;

2.LifeScienceandBiotechniqueResearchCenter,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150090,China)

Abstract：Molecular identification for cytoplasm polymorphism of Beta vulgaris cicla L materials SWTY-1 was conducted in this paper. Polymorphisms in mtDNA TR2 locus of Beta vulgaris cicla SWTY-1 were analyzed using variable number of tandem repeats (VNTRs) molecular markers method. The result showed that the numbers of tandem repeats in mtDNA TR2 locus were three-copy array of tandem repeats in 97 single plants among the 100 plants of Swiss chard, which was consistent with sugar beet. Six-copy VNTRs in mtDNA TR2 locus were found in 3 single plants among the population. Two plants could not bolt among the three plants whose VNTRs copy numbers were six. One plant bolting late could not form normal seeds among the three plants whose VNTRs copy number were six. Only two plant among the 97 plants with three-copy in TR2 locus failed to bolt normally and others bolt normally and form seeds.

Keywords：Beta; Cytoplasm; Male sterility; mt DNA; Molecular markers

甜菜(Betavulgaris)是重要的糖料作物之一，屬于典型的異交作物[1]。由于甜菜開花器官的特殊結(jié)構(gòu)，大規(guī)模人工去雄很難操作，因此不育系親本材料選育是甜菜雜種生產(chǎn)的主要支柱。在甜菜雜交育種中選育不育系是一項(xiàng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力而又花費(fèi)較大的工作[2-3]。目前所有雜交栽培甜菜種子的生產(chǎn)都依賴于Owen發(fā)現(xiàn)的雄不育甜菜材料(CMS)細(xì)胞質(zhì)，種質(zhì)單一,各國(guó)研究者一直試圖尋找利用新的不育系血緣[4].近幾年，國(guó)外研究者主要發(fā)現(xiàn)了起源于巴基斯坦野生甜菜的S2型細(xì)胞質(zhì)不育系1-12CMS(3)和起源于法國(guó)野生沿海甜菜的S3 型細(xì)胞質(zhì)不育系 CMS 2種新材料，研究者正在對(duì)新發(fā)現(xiàn)材料的線粒體DNA序列多態(tài)性及育性機(jī)理進(jìn)行研究，試圖補(bǔ)充Owen學(xué)說，并作為新的候選CMS種質(zhì)材料應(yīng)用到甜菜生產(chǎn)中，研究者正在積極發(fā)掘新的甜菜屬細(xì)胞質(zhì)類型補(bǔ)充甜菜種質(zhì)資源的研究[5]。

數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列(Variable Number of Tandem Repeats，VNTRs) 又稱小衛(wèi)星DNA (Minisatellite DNA)，為10到幾百核苷酸，拷貝數(shù)10～1 000不等, 在動(dòng)物細(xì)胞線粒體中廣泛存在，被子植物物種中目前只在甜菜中檢測(cè)到VNTRs的存在[6]。2000年日本研究人員Nishizawa S 等首次報(bào)道在甜菜細(xì)胞質(zhì)線粒體DNA中不相關(guān)連的4個(gè)TR位點(diǎn)存在數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)序列，分別為TR1、TR2、TR3、TR4位點(diǎn)；糖用栽培甜菜和沿海甜菜群體中線粒體TR1位點(diǎn)32 bp 的串聯(lián)重復(fù)序列分別為3～13拷貝不等，其中糖甜菜 Owen型不育系、保持系、普通受粉系TR1位點(diǎn)的VNTRs分別為4拷貝、13拷貝和6拷貝；沿海甜菜(B.maritima)中出現(xiàn)2拷貝，5拷貝，7拷貝，8拷貝；在TR3和TR4位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列也出現(xiàn)不同拷貝數(shù)的多態(tài)性，但這些材料在TR2位點(diǎn)均為3拷貝，未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性[7]。本研究利用VNTRs標(biāo)記，針對(duì)中國(guó)甜菜屬厚皮菜(BetavulgarisLinn.var.ciclaL)材料SWTY-1群體中100個(gè)單株的線粒體DNA中TR2位點(diǎn)VNTRs片段進(jìn)行分析，試圖尋找新的細(xì)胞質(zhì)類型并在田間對(duì)其抽薹結(jié)籽現(xiàn)象進(jìn)行觀察。葉用甜菜厚皮菜又名牛皮菜，甜菜屬(Beta)，藜科(Chenopodiaceae)的一種，二年生草本植物，原產(chǎn)歐洲地中海沿岸，以幼苗或葉片作蔬菜用，尤其在西方烹調(diào)中被廣泛應(yīng)用[8]。期望通過對(duì)該材料的研究，為甜菜屬新型細(xì)胞質(zhì)種質(zhì)資源的利用提供理論基礎(chǔ)，為甜菜屬不育植株不育機(jī)制的解釋提供新的研究材料與數(shù)據(jù)，同時(shí)豐富甜菜屬細(xì)胞質(zhì)資源的分子數(shù)據(jù)。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

甜菜屬厚皮菜材料群體SWTY-1為葉用甜菜種子材料，由哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院甜菜育種研究室提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1單株葉片總DNA 的提取

每個(gè)試驗(yàn)單株取0.05 g 葉片，參照文獻(xiàn)[9-10]方法，應(yīng)用提取緩沖液( 0.5 mol·L-1NaCl ，50 mmol·L-1EDTA, 100 mmol·L-1Tris-HCI ，10 mmol·L-1巰基乙醇)和氯仿.異戊醇(24∶1)進(jìn)行DNA提取實(shí)驗(yàn)，分別獲得群體中每個(gè)單株材料的總DNA。0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA質(zhì)量，模板DNA終濃度調(diào)至20～25 ng·μL-1。

1.2.2單株TR2位點(diǎn)VNTRs片段多態(tài)性PCR檢測(cè)

參照Nishizawa S等的文獻(xiàn)報(bào)道，根據(jù)甜菜細(xì)胞質(zhì)中線粒體TR2位點(diǎn)微衛(wèi)星串聯(lián)重復(fù)序列兩端的保守序列設(shè)計(jì)合成上游引物和下游引物序列[5]. 進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)反應(yīng)。每個(gè)單株的 PCR反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)組成為：模板DNA 20～30 ng；上游和下游引物分別為0.30 μmol·L-1； dNTPs 0.2 mmoI·L-1，MgCl22.5 mmol·L-1, Taq酶0.8 U。引物序列片段由上海生物工程公司合成。dNTP 、Taq酶、 DL2000購(gòu)自TaKaRa公司。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，25個(gè)循環(huán), 72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電壓90 V，電泳適當(dāng)距離后取出，在紫外燈下拍照記錄。

1.2.3VNTRs片段的回收與測(cè)序

特殊的VNTRs PCR片段使用BioSpin Gel Extraction Kit回收試劑盒進(jìn)行回收，具體操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行，回收片段的測(cè)序工作由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。根據(jù)測(cè)序結(jié)果確定不同于對(duì)照特殊單株TR2位點(diǎn)的拷貝數(shù)。

1.2.4試驗(yàn)材料的抽薹結(jié)實(shí)特性田間觀察

經(jīng)冬季低溫春化處理后的植株于次年春季栽于田間，待抽苔開花時(shí)，根據(jù)是否正常抽苔結(jié)籽觀測(cè)單株的育性特點(diǎn)。

2結(jié)果與分析

2.1甜菜屬厚皮菜TR2位點(diǎn)VNTRs片段多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果及細(xì)胞質(zhì)類型分析

從甜菜屬厚皮菜群體中隨機(jī)取樣100個(gè)單株進(jìn)行細(xì)胞質(zhì) DNA TR2位點(diǎn)VNTRs片段多態(tài)性標(biāo)記檢測(cè)。瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，在 DNA Marker旁邊的泳道分別點(diǎn)入測(cè)序鑒定后的3拷貝對(duì)照PCR產(chǎn)物及測(cè)試樣品PCR產(chǎn)物。圖1為對(duì)照及待測(cè)單株TR2位點(diǎn)VNTRs片段多態(tài)性檢測(cè)PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖片。參照文獻(xiàn)[7]，TR2位點(diǎn)3拷貝PCR產(chǎn)物序列為362 bp, 6拷貝為461 pb。3個(gè)單株P(guān)CR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳明顯不同于3拷貝單株P(guān)CR產(chǎn)物，回收測(cè)序結(jié)果顯示微衛(wèi)星序列串聯(lián)重復(fù)6次，為6拷貝，PCR產(chǎn)物序列為461 bp。100個(gè)單株的線粒體TR2位點(diǎn)VNTR片段PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)后得出的微衛(wèi)星串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)結(jié)果見表1。

圖1　線粒體TR2位點(diǎn)VNTRs多態(tài)性PCR產(chǎn)物電泳圖譜

注：M：DL2000 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：3拷貝對(duì)照； 2-8：3拷貝VNTRs單株； 9-10：6拷貝VNTRs單株。

Notes: M：DL2000 DNA marker. No.1: 3 copies CK. No.2～8: 3 copies VNTRs sing plant. No.9 ～10: 6 copies VNTRs sing plant.

表1　TR2位點(diǎn)VNTRs片段拷貝數(shù)及育性特點(diǎn)

表1中看出，甜菜屬厚皮菜群體所檢測(cè)的100個(gè)單株TR2位點(diǎn)VNTRs片段分別為3拷貝和6拷貝，出現(xiàn)多態(tài)性，其中97個(gè)植株中線粒體TR2位點(diǎn)VNTR片段為3拷貝，與Nishizawa S 等報(bào)道的糖用栽培甜菜TR2位點(diǎn)的細(xì)胞質(zhì)類型一致，3個(gè)植株中線粒體TR2位點(diǎn)VNTR片段為6拷貝, 線粒體TR2位點(diǎn)出現(xiàn)6拷貝現(xiàn)象的單株數(shù)在該試驗(yàn)群體中占3%。根據(jù)Satsuki Nishizawa等的報(bào)導(dǎo)[6]，在研究的甜菜屬不同糖甜菜栽培種和沿海甜菜群體中線粒體DNA TR2 位點(diǎn)中未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，均為3拷貝。本實(shí)驗(yàn)在葉用甜菜厚皮菜群體的單株中檢測(cè)到線粒體DNA TR2位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列(VNTRs)出現(xiàn)6拷貝單株，存在多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)了甜菜屬新的細(xì)胞質(zhì)單株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明葉用甜菜-厚皮菜群體中細(xì)胞質(zhì)多樣性比糖用栽培甜菜更為廣泛，TR2位點(diǎn)出現(xiàn)多態(tài)性。

2.2100個(gè)單株的田間育性觀測(cè)結(jié)果分析與討論

從幼苗至繁茂期，對(duì)群體植株的農(nóng)藝性狀進(jìn)行觀察，該群體中100個(gè)植株的田間生長(zhǎng)形態(tài)及株型并無(wú)明顯差異。100個(gè)單株的抽薹結(jié)籽特性并不完全相同。田間花期抽薹及植株育性調(diào)查結(jié)果見表1。該群體100個(gè)單株中TR2位點(diǎn)VNTRs片段分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果拷貝數(shù)為3的群體中95個(gè)植株能夠正常抽薹結(jié)籽屬于正?？捎牧?，2個(gè)單株未能抽薹結(jié)籽；TR2位點(diǎn)VNTRs片段拷貝數(shù)為6的植株中2個(gè)單株不能正常抽苔開花，1個(gè)植株抽薹晚，獲得的種子粒小，種仁干癟，不能萌發(fā)形成幼苗。新發(fā)現(xiàn)的TR2位點(diǎn)VNTRs片段拷貝數(shù)為6的3個(gè)植株個(gè)體均不能正常結(jié)籽，此現(xiàn)象出現(xiàn)的原因有待進(jìn)一步解釋與研究，該試驗(yàn)鑒定結(jié)果并不能完全證明線粒體DNA中TR2位點(diǎn)微衛(wèi)星串聯(lián)數(shù)目的改變直接與甜菜屬植株的育性變化相關(guān)，因?yàn)橹仓陻?shù)量少有待更多群體的驗(yàn)證，而且細(xì)胞質(zhì)TR2位點(diǎn)VNTRs片段拷貝數(shù)為3的2個(gè)單株也不能正常抽薹，對(duì)于引起單株抽薹異常不能正常形成可育種子的原因和機(jī)理有待深入探討，將成為本課題組下一步研究的目標(biāo)之一。

3結(jié)論

100個(gè) 甜菜屬厚皮菜單株的線粒體基因組TR2位點(diǎn)的微衛(wèi)星串聯(lián)序列重復(fù)次數(shù)(VNTRs)的分子檢測(cè)結(jié)果表明，甜菜屬厚皮菜群體中97%個(gè)體的細(xì)胞質(zhì)TR2位點(diǎn)的微衛(wèi)星串聯(lián)序列重復(fù)次數(shù)與Nishizawa S等報(bào)導(dǎo)的糖甜菜栽培種和其他沿海甜菜細(xì)胞質(zhì)一樣，TR2位點(diǎn)VNTRs拷貝數(shù)均為3拷貝；厚皮菜群體中3%個(gè)體的細(xì)胞質(zhì)中線粒體DNA上TR2位點(diǎn)的DNA序列發(fā)生改變，微衛(wèi)星串聯(lián)序列重復(fù)次數(shù)由3拷貝變異為6拷貝，出現(xiàn)多態(tài)性，首次發(fā)現(xiàn)了TR2位點(diǎn)VNTRs為6拷貝的新的細(xì)胞質(zhì)單株。微衛(wèi)星串聯(lián)重復(fù)序列為6拷貝的植株中2個(gè)單株花期未抽苔開花，1株抽苔晚未形成正常種子，線粒體DNA中一些位點(diǎn)微衛(wèi)星串聯(lián)數(shù)目的改變與甜菜屬植株的育性變化是否具有相關(guān)性有待更深入的研究及大量單株材料線粒體DNA序列的分子鑒定與田間育性調(diào)查的相結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)在葉用甜菜厚皮菜SWTY-1群體的單株中首次檢測(cè)到了線粒體DNA TR2位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列(VNTRs)出現(xiàn)6拷貝多態(tài)性。說明葉用甜菜群體中細(xì)胞質(zhì)多樣性較糖用甜菜更為廣泛。該特殊的多態(tài)性細(xì)胞質(zhì)材料的發(fā)現(xiàn)為甜菜屬植物育性機(jī)理的進(jìn)一步深入探索提供了新的植物種質(zhì)資源研究材料。

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*通信作者：豐繼華，男，副教授，研究方向：生物信息處理；E-mail：fengjihua@21cn.com.