脊髓繼發性損傷大鼠脊髓組織中丙烯醛表達、SOD活性及MDA含量變化

脊髓繼發性損傷大鼠脊髓組織中丙烯醛表達、SOD活性及MDA含量變化

張月娥1，許燦1，藺靜1，黃一茜1，張靜2

(1保定市第一中心醫院，河北保定071000；2河北醫科大學附屬第三醫院)

摘要：目的觀察脊髓繼發性損傷大鼠脊髓組織中丙烯醛(ACR)表達、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量變化。方法健康雄性SD大鼠48只，隨機分為實驗組30只、假手術組18只。實驗組采用改良Allen′s-WD法制備大鼠脊髓繼發性損傷模型，假手術組暴露脊髓后立即縫合。分別于建模后24 h、3 d、7 d處死大鼠，取脊髓組織，HE染色觀察脊髓組織病理變化，采用免疫組化法檢測脊髓組織中的ACR，采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性，硫代巴比妥酸法檢測MDA。結果實驗組建模后24 h、3 d、7 d脊髓組織中ACR表達量、MDA含量高于相應時點假手術組(P均<0.05)。實驗組建模后24 h、3 d、7 d脊髓組織SOD活性低于假手術組(P均<0.01)。結論 大鼠脊髓繼發性損傷組織中ACR表達及MDA含量升高，SOD活性降低。

關鍵詞：脊髓損傷；脊髓繼發性損傷；丙烯醛；超氧化物歧化酶；丙二醛

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.39.010

中圖分類號：R651.2文獻標志碼：A

收稿日期：(2015-06-27)

通信作者：張靜

氧化應激反應在脊髓繼發性損傷的發生和進展中發揮重要作用[1]。研究[2]表明，氧化應激反應產生大量自由基如丙二醛(MDA)，耗竭內源性抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)，破壞內源性抗氧化系統，導致脊髓組織損傷進一步加重。臨床清除自由基療法尚未取得滿意效果,有學者推測脊髓繼發性損傷后可能有毒性更強、半衰期更長的氧化應激產物如丙烯醛(ACR)等產生，使損傷持續進展。2010年5月~2011年1月，我們觀察了大鼠脊髓繼發性損傷組織中ACR表達、SOD活性及MDA含量變化，并探討其意義。

1材料與方法

1.1實驗動物與材料SPF級健康雄性SD大鼠48只，體質量240~280 g。兔抗丙烯醛多克隆抗體，PV9003、DAB顯色試劑盒，EZ ECL試劑盒，SOD試劑盒及MDA試劑盒，分光光度計，石蠟切片機，低溫冰箱，半干電轉移槽及垂直電泳槽等。

1.2大鼠脊髓繼發性損傷模型建立將48只SD大鼠隨機分為實驗組30只、假手術組18只。實驗組根據改良Allen′s-WD法制作脊髓繼發性損傷模型：0.3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉，暴露T11段脊髓，將打擊裝置整合于立體定位儀上，將一直徑3 mm圓形薄金屬墊片(3 mm×4 mm，質量0.1 g)置于T11段脊髓表面，以10 g砝碼從6.5 cm高度自由墜落打擊墊片，造成以T11段為中心的脊髓急性損傷。假手術組暴露脊髓后立即縫合。分別于建模后24 h、3 d、7 d處死大鼠，取原手術切口暴露T10~12段，在冰袋上解剖椎管，取出包括損傷段及損傷階段上下段脊髓組織(繼發性損傷組織)2 cm置于-80 ℃冰箱中保存，留作SOD、MDA檢測。取大鼠脊髓組織，浸入4%中性甲醛溶液12~24 h后，留取損傷區及其上下各0.5 cm范圍的脊髓組織，以備組織病理學檢查及ACR檢測。

1.3脊髓組織病理觀察將脊髓組織常規切片脫蠟至水，HE染色后于普通顯微鏡下觀察組織形態學變化情況。

1.4脊髓組織中ACR、SOD、MDA檢測分別于建模后24 h、3 d、7 d采用免疫組化法檢測脊髓組織中的ACR，以陽性細胞染色的平均光密度值代表表達量。采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性。采用硫代巴比妥酸法檢測MDA。

1.5統計學方法采用SPSS13.0統計軟件。計量資料比較用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1脊髓組織病理變化假手術組神經元細胞形態、數量正常。實驗組建模后24 h可見局灶性出血，神經元腫脹、變圓、數目減少，神經元核固縮、碎裂，尼氏小體淡染或消失；建模后7 d神經元數目減少，內有空泡形成。

2.2兩組脊髓組織中ACR表達、SOD活性、MDA含量比較實驗組建模后24 h、3 d、7 d脊髓組織中ACR表達、MDA含量高于相應時點假手術組(P均<0.05)。實驗組建模后24 h、3 d、7 d脊髓組織SOD活性低于相應時點假手術組(P均<0.01)。見表1。

表1　 建模后不同時點兩組脊髓組織中ACR表達、

SOD活性、MDA含量比較( ± s)

表1　 建模后不同時點兩組脊髓組織中ACR表達、

組別nACRSOD活性(U/mgprot)MDA含量(nmol/mgprot)實驗組30 建模后24h0.3636±0.0100124.7±8.812.30±1.20 建模后3d0.3462±0.0157137.7±4.811.90±1.14 建模后7d0.3052±0.0162145.9±5.711.01±1.09假手術組18 建模后24h0.1613±0.3910*241.3±12.3#6.34±0.50# 建模后3d0.1762±0.2143*262.6±15.6#6.35±0.64# 建模后7d0.2036±0.2452*255.7±16.4#7.01±0.45#

注：與同時點實驗組相比，*P<0.05；與同時點實驗組相比，#P<0.01。

3討論

脊髓繼發性損傷發生在原發性損傷后數小時、數天及數周，可導致原發傷周圍正常脊髓組織損傷[1]，繼發性損傷機制包括缺血再灌注損傷、炎癥、氧化應激及谷氨酸等興奮性氨基酸毒性等[3]。自由基介導的氧化應激反應被認為是引起脊髓繼發性損傷的關鍵因素之一[4]。然而目前現有的清除自由基療法臨床療效并不滿意。

研究[5]表明，丙烯醛的損傷作用機制包括兩個方面：其一是作為脂質過氧化反應的誘發者，誘發氧化應激反應進入惡性循環，造成細胞永久損傷；其二是通過與蛋白耦聯引起細胞凋亡。有學者[6]建立了體外PC12細胞損傷模型，發現ACR可誘導細胞凋亡，且ACR的細胞毒性較MDA、HNE及其他脂質過氧化產物更強。Due等[7]發現，在大鼠脊髓損傷模型中，ACR表達顯著增加，推測其在大鼠運動癱瘓及神經病理性疼痛的發生中可能起重要作用。在豚鼠離體壓縮性脊髓損傷模型中，ACR表達在脊髓損傷后4 h開始增高，24 h后達到峰值并能持續1周甚至更長時間，使ACR對脊髓的損傷作用持續存在，而使用其特效清除劑后，神經元細胞膜損傷明顯減輕[8]。

MDA也是脂質過氧化反應的代謝產物[9]，可反映細胞受損后氧自由基含量變化及脂質過氧化反應的程度。SOD是超氧自由基的特異性清除酶，能明顯減輕自由基介導的脂質過氧化損傷，其活性高低可反映機體抗氧化能力的強弱[10]。在繼發性損傷早期，SOD活力值最高，機體內源性抗氧化系統發揮作用；然而，隨著ACR表達持續存在，MDA含量逐漸增加，SOD不斷耗竭，SOD活性也逐漸降低。研究[11]表明，ACR在神經退行性疾病患者腦組織中水平升高，增強氧化應激水平，引起MDA含量升高，SOD活性下降。

本研究發現，實驗組建模后24 h、3 d、7 d脊髓組織中ACR表達量、MDA含量高于相應時點假手術組，SOD活性低于相應時點假手術組。上述結果提示，脊髓損傷后機體內部即產生ACR、MDA，隨著ACR、MDA持續生成，SOD活性降低，脊髓損傷持續存在。結合病理觀察結果，實驗組隨建模時間延長，脊髓組織病理變化逐漸加重，進一步表明大鼠脊髓損傷后，體內ACR及自由基大量釋放，對神經細胞造成嚴重破壞。今后我們將研究ACR表達與自由基生成的相關性，尋找相關清除劑以期減輕ACR對脊髓組織的損傷程度。

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