Survivin基因沉默對結直腸癌細胞增殖、遷移能力的影響

Survivin基因沉默對結直腸癌細胞增殖、遷移能力的影響

曹洪華

(貴港市人民醫(yī)院，廣西貴港537100)

摘要：目的觀察結直腸癌細胞中Survivin的表達情況，及Survivin基因沉默對結直腸癌細胞增殖、遷移能力的影響。方法培養(yǎng)正常結腸上皮細胞系NCM460及結直腸癌細胞株SW480，將SW480細胞分為實驗組和對照組(留取部分細胞待測Survivin mRNA及蛋白)，實驗組轉染Survivin siRNA，對照組轉染control siRNA。檢測NCM460細胞、SW480細胞、實驗組及對照組細胞中的Survivin mRNA及蛋白；實驗組及對照組轉染48 h后，采用MTT實驗檢測兩組細胞增殖能力，Transwell實驗和劃痕實驗檢測細胞遷移能力。結果NCM460細胞中Survivin mRNA、蛋白相對表達量分別為0.16±0.10、0.20±0.15，SW480細胞中Survivin mRNA、蛋白相對表達量分別為1.00±0.00、1.00±0.00，二者相比，P均<0.05。轉染48 h后，實驗組細胞中Survivin mRNA、蛋白相對表達量分別為0.20±0.13、0.31±0.12，對照組細胞中Survivin mRNA、蛋白相對表達量分別為1.00±0.00、1.00±0.00，兩組相比，P均<0.05。兩組轉染48 h后，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72 h實驗組細胞增殖能力低于對照組(P均<0.05)。實驗組每視野穿膜細胞數為(140±15)個，對照組為(27±6)個，兩組相比，P<0.05。結論Survivin基因沉默可抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移能力。

關鍵詞：結腸癌；直腸癌；生存素；基因沉默技術；細胞增殖；細胞遷移

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.39.009

中圖分類號：R735.3文獻標志碼：A

收稿日期：(2015-06-05)

近年來，我國結直腸癌的發(fā)病率呈現快速增長趨勢[1，2]。研究表明，結直腸癌的形成和轉移是多基因、多因素共同作用的結果。Survivin為凋亡抑制蛋白(IAP)家族的成員之一，能抑制細胞凋亡，促進細胞增殖，參與調節(jié)細胞的有絲分裂，并可能參與血管形成。Survivin在多數腫瘤組織中高表達，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[3，4]。2014年12月~2015年3月，我們通過在結直腸癌細胞株SW480中轉染siRNA，沉默Survivin基因，觀察腫瘤細胞增殖及遷移能力的變化，現報告如下。

1材料與方法

1.1主要材料與試劑正常結腸上皮細胞系NCM460和結直腸癌SW480細胞株購自中科院上海細胞研究所。所有抗體購自Abcam公司。siRNA購自上海吉凱基因公司。胎牛血清和胰蛋白酶購自Invitrogen公司。L-15、RPMI-1640、McCoy′5A購自Gibco公司。RNA提取試劑TRIzol購自上海Fastagen公司。反轉錄試劑盒購自日本Toyobo公司。PCR相關試劑購自北京天為公司。real-time PCR儀購自Eppendorf公司。PVDF膜、封閉液、洗脫液、脫脂奶粉、蛋白提取液及相關試劑購自碧云天生物研究所。450型酶標儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2細胞分組與Survivin siRNA轉染方法正常結直腸上皮細胞株NCM460常規(guī)培養(yǎng)于含有15%胎牛血清的DMEM中。結直腸癌細胞株SW480常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)液中，取對數生長期細胞在感染前1 d用胰蛋白酶消化傳代，使其在轉染當天融合率為30%~50%。將SW480細胞分為實驗組及對照組(留取部分細胞待測Survivin mRNA及蛋白)，其中實驗組細胞轉染Survivin siRNA，對照組細胞轉染control siRNA。將培養(yǎng)板置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h(實驗組培養(yǎng)6~8 h后，將含siRNA-Lipofectamine2000混合液的培養(yǎng)基移去，換為新鮮的生長培養(yǎng)基)，檢測沉默效果，進行后續(xù)實驗。

1.3Survivin mRNA及蛋白檢測①Survivin mRNA檢測：按TRIzol試劑盒說明書步驟，抽提NCM460細胞、SW480細胞、實驗組和對照組細胞的總RNA，并利用一步法逆轉錄試劑盒，通過RT-PCR生成cDNA；以cDNA作為模板，采用real-time PCR檢測Survivin mRNA；Survivin上游引物序列為5′-GCATGGGTCCCCCGACGTTG-3′、下游引物序列為5′-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-3′，內參GAPDH上游引物序列為5′-TCAACGGATTTGGTCGTATTGGGC-3′、下游引物序列為5′-TCCTGGAAGATGGTGATGGGATTT-3′；反應條件為95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，55 ℃退火1 min，循環(huán)40 次；各樣本重復測量3次，根據2-ΔΔCt公式計算mRNA相對表達量。②Survivin蛋白檢測：收集NCM460細胞、SW480細胞、實驗組和對照組細胞，加入裂解液冰浴30 min，離心后取上清并測定蛋白濃度；分別取50 μg樣品進行SDS-PAGE，轉至PVDF 膜上，加入5%脫脂奶粉封閉液，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉2 h，加Survivin單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗兔IgG(二抗)，37 ℃孵育1 h，ECL 熒光顯色，使用Quantity One4.2軟件計算蛋白條帶的灰度值。待測蛋白表達量=待測蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.4SW480細胞增殖能力檢測轉染48 h后取實驗組及對照組細胞接種于96孔板，每組設6個復孔，分別于培養(yǎng)6、12、24、48、72 h每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，4 h后棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)終止，振蕩15 min，450型酶標儀570 nm波長下檢測吸光度值(OD值)，以此反映細胞增殖能力。

1.5SW480細胞遷移能力檢測實驗組與對照組細胞轉染48 h后，吸出培養(yǎng)板中殘余液體，消化細胞后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1~2遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調整細胞密度至1×106/mL，取細胞懸液100 μL加入Transwell 小室，下室加入900 μL 含10% FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。用0.4%多聚甲醛固定30 min，風干10 min，0.1%結晶紫染色20 min后，用PBS清洗并晾干。將小室正置于載玻片上，在倒置顯微鏡下觀察4個視野并照相，計算穿膜細胞數。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，兩組比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1NCM460細胞、SW480細胞中Survivin mRNA及蛋白表達情況NCM460細胞中Survivin mRNA、蛋白相對表達量分別為0.16±0.10、0.20±0.15，SW480細胞中Survivin mRNA、蛋白相對表達量分別為1.00±0.00、1.00±0.00，二者相比，P均<0.05。

2.2實驗組、對照組細胞中Survivin mRNA及蛋白表達情況轉染48 h后，實驗組細胞中Survivin mRNA、蛋白相對表達量分別為0.20±0.13、0.31±0.12，對照組細胞中Survivin mRNA、蛋白相對表達量分別為1.00±0.00、1.00±0.00，兩組相比，P均<0.05。

2.3實驗組、對照組細胞增殖能力比較兩組轉染48 h后，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72 h細胞增殖能力相比，P均<0.05。見表1。

表1　實驗組、對照組細胞增殖能力比較(OD值， ± s)

表1　實驗組、對照組細胞增殖能力比較(OD值， ± s)

組別細胞增殖能力6h12h24h48h72h實驗組0.24±0.030.32±0.100.53±0.081.07±0.201.43±0.35對照組0.25±0.050.53±0.08*1.31±0.41*1.89±0.43*2.20±0.32*

注：與實驗組相比，P<0.05。

2.4實驗組、對照組細胞遷移能力比較實驗組每個視野穿膜細胞數為(140±15)個，對照組為(27±6)，兩組相比，P<0.05。

3討論

結直腸癌目前采用手術切除為主、放化療為輔的綜合治療，但中晚期結直腸癌治療效果并不理想。Survivin是一種凋亡抑制蛋白，是凋亡抑制因子中作用最強的一種，具有參與調節(jié)細胞有絲分裂、促進細胞增殖及抑制細胞凋亡的作用[5，6]。Survivin主要在G2/M期表達，G2/M期控制點負責保持遺傳的準確性，通過Survivin對細胞周期的調節(jié)作用，使腫瘤細胞逃避細胞周期G2/M期檢測點的監(jiān)測，從而抵抗因DNA損傷或突變自身誘導的細胞凋亡，導致腫瘤細胞異常分裂增殖[7]。在生理狀態(tài)下，Survivin僅表達于成人分泌期子宮內膜、胎盤、睪丸、胸腺及胚胎組織中；病理狀態(tài)下，Survivin廣泛表達于各種惡性腫瘤組織中, 如胃癌、食管癌、肝癌、膀胱癌、肺癌等[8~11]，其高表達與患者的短生存率、預后不良及化放療抵抗有關[12]。本研究發(fā)現，SW480細胞中Survivin基因和蛋白呈高表達，而在NCM460細胞中呈低表達，與相關研究結果一致[13]。研究[14，15]表明，Survivin表達發(fā)生在結直腸腺癌惡性轉化的早期，在癌變過程中起重要作用。Survivin的表達上調與直腸癌細胞凋亡指數下降、轉移率增高、患者總體生存期縮短、預后不良有關[16]。

siRNA是一種短片段雙鏈RNA 分子，能以同源互補序列的mRNA為靶目標降解特定的mRNA，導致相應基因沉默[17]。Wang等[18]研究發(fā)現，在乳腺癌細胞MCF7中，轉染siRNA能抑制Survivin mRNA及蛋白的表達，同時還能抑制細胞增殖及凋亡。本研究結果顯示，在SW480細胞中轉染siRNA后，Survivin mRNA及蛋白的表達明顯降低。我們檢測細胞增殖及遷移能力后發(fā)現，實驗組細胞增殖及遷移能力均低于對照組。上述結果表明轉染Survivin siRNA后，SW480細胞的增殖、遷移能力受到抑制，抑制腫瘤細胞中Survivin的表達可能是腫瘤基因治療的一個潛在靶點。

總之，我們發(fā)現，Survivin基因及蛋白在結直腸細胞中高表達，沉默Survivin基因能抑制結直腸癌細胞的增殖及遷移能力。鑒于Survivin基因在結直腸癌細胞中高表達的特性，通過RNAi技術，可抑制特定序列Survivin mRNA表達，結合手術治療，有望提高結直腸癌的治療效果，延長患者生命。

參考文獻：

[1] Siegel R, Naishadham D, Jemal A, et al. A Cancer statistics, 2012[J].CA Cancer J Clin, 2012,62(1):10-29.

[2] 周總光,楊烈,李園,等.我國結直腸癌30年變遷與應對策略[J].中國實用外科雜志,2012,9(32):693-696.

[3] Rohayem J, Diestelkoetter P, Weigle B, et al.Antibody response to the tumor-associated inhibitor of apoptosis protein survivin in cancer patients[J].Cancer Res, 2000,60(7):1815-1817.

[4] 楊小冬,黃平,王鋒,等．結直腸癌患者預后相關因素分析[J].江蘇醫(yī)藥,2010，36( 24):2903-2906.

[5] Kesireddy V, Vander Ven PF, Furst DO. Multipurpose modular lentiviral vectors for RNA interference and transgene expression[J]. Mol Biol Rep, 2010,37(6):2863-2878.

[6] Velculescu VE, Madden SL, Zhang L, et al. Analysis of human transcriptomes[J]. Nat Genet, 1999,23(4):387-388.

[7] Chandele A, Prasad V, Jagtap JC, et al. Upregulation of survivin in G2/M cells and inhibition of caspase 9 activity enhances resistance in staurosporine-induced apoptosis[J]. Neoplasia， 2004，6(1):29-40.

[8] Andersen MH, Svane IM, Becker JC, et al.The universal character of the tumor-associated antigen survivin[J] .Clin Cancer Res, 2007,13(20):5991-5994.

[9] Montorsi M, Maggioni M, Falleni M, et al. Survivin geneexpression in chroni cliver disease and hepatocellular carcinoma[J]. Hepatogastroenterology, 2007,54(79):2040-2044.

[10] Kitamura H,Torigoe T, Honma I, et al. Expression and antigenicity of survivin ,an inhibitor of apoptosi s family member, in bladder cancer:impli cations for specific immunotherapy[J]. Urology, 2006,67(5):955-959.

[11] Olie RA, Simoes-Wust AP, Baumann B, et al. A novel antisense oligonucleotide targeting survivin expression induces apoptosis and sensitizes lung cancer cells to chemotherapy[J]. Cancer Res, 2000,60(11):2805-2809.

[12] Ambrosini G, Adida C, Altieri DC. A novel anti-apoptosis gene,survivin, expressed in cancer and lymphoma[J]. Nat Med, 1997,3(8):917-921.

[13] 郭勇杭,劉中宏,許軍,等.聯(lián)合轉染Survivin shRNA和CD44v3 shRNA對結直腸癌SW480細胞增殖和侵襲能力的影響[J].世界華人消化雜志,2011,19(9):905-911.

[14] 鄭長青,林連捷,馬穎,等.大腸黏膜癌變過程中Survivin蛋白的表達[J].世界華人消化雜志,2002,10(9):1052-1053.

[15] Lin LJ, Zheng CQ, Jin Y, et al.Expression of survivin protein in human colorectal carcinogenesis[J]. World J Gastroenterol, 2003,9(5): 974-977.

[16] R?del F, Hoffmann J, Grabenbauer GG, et al. High survivin expression is associated with reduced apoptosis in rectal cancer and may predict disease-free survival after preoperative radiochemotherapy and surgical resection[J]. Strahlenther Onkol, 2002,178(8): 426-435.

[17] 何滿西,李耿,姚有貴,等.胰腺癌細胞survivin表達RNAi抑制載體的構建及其抑制作用的研究[J].中國普外基礎與臨床雜志,2008,15(11):829-834 .

[18] Wang H, Ye YF. Effect of survivin siRNA on biological behaviour of breast cancer MCF7 cells[J]. Asian Pac J Trop Med, 2015,8(3):225-228.