十二指腸空腸旁路術治療后T2DM大鼠血糖水平及回腸組織中GLUT-1表達觀察

·基礎研究·

十二指腸空腸旁路術治療后T2DM大鼠血糖水平及回腸組織中GLUT-1表達觀察

馮啟凱1，季萬勝2，楊洪鳴1，郭瑜1，劉鳳嬌1，曲梅花1

(1濰坊醫學院山東省高校應用藥理學重點強化建設實驗室，山東濰坊261053；2濰坊醫學院附屬醫院)

摘要：目的觀察十二指腸空腸旁路術(DJB)后2型糖尿病(T2DM)大鼠血糖水平及回腸組織中葡萄糖轉運蛋白-1(GLUT-1)的表達變化。方法雄性Wistar大鼠36只，隨機分為空白組、模型組和手術組。模型組和手術組以腹腔注射鏈脲佐菌素建立T2DM模型。手術組施行DJB術。分別于術后第1、4、8周(空白組、模型組于同一時間)測大鼠空腹血糖、空腹胰島素水平。術后第8周處死大鼠，分別采用免疫熒光雙標記法及Western blotting法檢查回腸組織中的GLUT-1。結果手術組術后1、4、8周后空腹血糖、空腹胰島素水平降低，與術前相比，P均<0.01；手術組、空白組術后1、4、8周空腹血糖及空腹胰島素水平低于模型組(P均<0.01)。手術組、模型組、空白組GLUT-1陽性細胞數分別為(226±7)、(78±5)、(46±4)個，三組兩兩相比，P均<0.01；手術組、模型組、空白組回腸組織中GLUT-1相對表達量分別為1.642 1±0.213 4、0.723 2±0.126 2、0.315 4±0.075 1，三組兩兩相比，P均<0.01。結論 DJB術后T2DM大鼠血糖水平降低，回腸組織中GLUT-1表達增高，其降糖作用可能與調節GLUT-1表達有關。

關鍵詞：2型糖尿病；十二指腸空腸旁路術；血糖；葡萄糖轉運蛋白1；動物實驗

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.39.008

中圖分類號：R587.1文獻標志碼：A

收稿日期：(2015-07-27)

通信作者：曲梅花

國際糖尿病聯盟(IDF)認為減重手術是血糖控制不良尤其伴高血壓、血脂異常及肥胖2型糖尿病(T2DM)患者的適宜治療手段[1，2]。有學者[3，4]評估了減重手術和藥物治療的有效性和安全性，但手術治療糖尿病的機制一直未明確。葡萄糖轉運蛋白1(GLUT-1)是分布最廣泛的葡萄糖轉運蛋白[5]，可介導葡萄糖在細胞內外的轉運。鑒于小腸是葡萄糖吸收的主要部位，2015年2~6月，我們觀察了十二指腸空腸旁路術(DJB)治療后T2DM大鼠血糖水平及回腸組織中GLUT-1的表達變化，現報告如下。

1材料與方法

1.1實驗材料雄性Wistar大鼠36只，SPF級，體質量200~220 g，由山東魯抗醫藥股份有限公司實驗動物室提供(許可證號SCXK魯20130001)；鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司；安穩血糖儀和血糖試紙條購自廣東三諾生物傳感股份有限公司；GLUT-1酶聯免疫檢測試劑盒購自美國RD公司；鼠抗人Antihu一抗、兔抗鼠GLUT-1一抗購自美國Milipore公司；驢抗鼠Cy3二抗、山羊抗兔FITC二抗購自北京博奧森生物技術有限公司；冰凍切片機購自德國LEICA公司；低溫冷凍離心機購自美國Sigma公司；奧林巴斯IX71熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；ZEISS全自動圖像分析儀購自北京普瑞賽司儀器有限公司。

1.2動物分組及DJB手術方法將大鼠隨機分為空白組、模型組、手術組，每組12只。模型組、手術組大鼠禁食12 h，以STZ 53 mg/kg腹腔注射，3 d后鼠尾末端靜脈取血，以空腹血糖>13.9 mmol/L且穩定7 d以上判定為T2DM模型制作成功[6]。手術組施行DJB手術：大鼠術前12 h禁食，術前6 h禁水；給予氯胺酮150 mg/kg腹腔注射麻醉；在胃幽門處剪斷十二指腸，縫合封閉斷端；于屈氏韌帶下約10 cm處剪斷空腸，空腸遠端與幽門部進行吻合，于空腸斷端下約7 cm處進行空腸近端吻合；用腹腔大網膜分別包繞上述兩個吻合口以防止吻合口漏[7]；術后27 ℃保溫，碘伏消毒腹部切口約1周，持續3 d腿部肌注青霉素5萬IU防感染，每天2次腰背部兩側皮下補液，3 d后半流質飲食，逐步過渡到正常飲食。

1.3血糖及胰島素檢測手術組于術后1、4、8周(模型組、空白組于同一時間)在大鼠尾端靜脈取血，用血糖儀測定大鼠空腹血糖。眼內眥采集靜脈血1 mL，室溫靜置于離心管30 min自凝，5 000r/min離心10 min后取上清，采用ELISA法檢測血清胰島素。

1.4回腸組織中GLUT-1檢測術后8周，將各組大鼠頸椎脫臼處死，取末端回腸3~4 cm，置于4%多聚甲醛固定15 min，冰凍切片，血清封閉，37 ℃恒溫孵育2 h，Antihu(鼠抗人，1∶150)+0.03% TritonX-100，4 ℃過夜，PBS漂洗，加入熒光二抗Cy3(驢抗鼠，1∶800)、GLUT-1R(兔抗鼠，1∶100)、二抗FITC(山羊抗兔，1∶150)，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。隨機選取10個高倍視野(200×)，記錄每個視野陽性細胞數目，取均值。冰塊上切取回腸組織5~8 cm，迅速液氮凍存；抽提蛋白質，Western blotting法檢測GLUT-1，用ZEISS全自動圖像分析儀及VIDAS數據分析儀，測定目的條帶的灰度值，以此作為蛋白相對表達量。

1.5統計學方法采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以±s表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1三組空腹血糖、空腹胰島素水平比較手術組術后1、4、8周后空腹血糖、空腹胰島素水平與術前相比，P均<0.01；手術組、空白組術后1、4、8周空腹血糖及空腹胰島素水平與模型組相比，P均<0.01。見表1。

表1　 三組大鼠手術前后空腹血糖、空腹胰島素

水平比較( ± s)

表1　 三組大鼠手術前后空腹血糖、空腹胰島素

組別空腹血糖(mmol/L)空腹胰島素(mIU/L)手術組 術前19.56±2.178.93±0.75 術后1周5.28±2.21*#4.98±0.84*# 術后4周5.52±2.24*#4.13±0.72*# 術后8周5.57±2.15*#4.25±0.85*#模型組 術前19.34±2.348.89±1.41 術后1周19.56±2.788.76±1.73 術后4周20.61±2.439.01±2.46 術后8周18.98±2.268.86±1.86空白組 術前5.62±0.65#3.88±0.68# 術后1周5.35±0.71#4.02±0.54# 術后4周5.49±0.46#3.95±0.76# 術后8周5.61±0.57#4.11±0.77#

注：與同組術前相比，*P<0.01；與模型組相比，#P<0.01。

2.2三組回腸組織中GLUT-1表達比較手術組、模型組、空白組GLUT-1陽性細胞數分別為(226±7)、(78±5)、(46±4)個，三組兩兩相比，P均<0.01。手術組、模型組、空白組回腸組織中GLUT-1相對表達量分別為1.642 1±0.213 4、0.723 2±0.126 2、0.315 4±0.075 1，三組兩兩相比，P均<0.01。見圖1。

注：1為空白組；2為模型組；3為手術組。

圖1各組大鼠回腸組織中GLUT-1表達比較

3討論

糖尿病是危害人類健康的常見病、多發病。針對T2DM因胰島素抵抗或(和)胰島素分泌缺陷引起的高血糖及并發癥，傳統治療手段以控制飲食、服用降糖藥物、注射胰島素為主，但很難達到治愈的效果。目前，關于減重手術治療糖尿病的研究逐漸增多。治療糖尿病的手術有多種類型，主要包括吸收不良型手術、限制性手術和兩者結合的術式[8]。DJB手術在傳統減重手術治療機制的基礎上，保留胃容積、將近端十二指腸曠置，用以治療非肥胖型T2DM。在本研究中，手術組術后8周大鼠空腹血糖值由(19.56±2.17)mmol/L下降到(5.57±2.15)mmol/L，降糖作用明顯。

DJB手術治療T2DM的機制一直未明，主要有以下幾種假說[9~12]：①腸-胰島軸假說；②脂肪-胰島軸假說；③胰島素樣生長因子假說；④腸道菌群改變假說。葡萄糖調節是一個全身性、復雜、有序、精密調控的過程，多種激素和生長因子相互協調。作為葡萄糖進出細胞的載體，GLUTs起重要作用。其中，GLUT-1在人體內分布最為廣泛，同時也是對體內微環境變化反應最為靈敏的GLUTs之一[13]。細胞糖代謝的第一個限速步驟是葡萄糖攝入，GLUT-1在此過程的調節中發揮重要作用[14]。體外細胞實驗發現GLUT-1的調控與細胞對葡萄糖的需求相一致[15]，GLUT-1的調控包括急性調控及慢性調控兩個方面。急性調控主要是調控GLUT-1從細胞內的貯存囊泡向細胞膜的轉位和GLUT-1內在活性方面，并不涉及GLUT-1 mRNA和蛋白質的合成調節。細胞膜上的GLUT-1在應激情況下會發生轉位進而使葡萄糖分子進入細胞的數量大幅度增加，同時GLUT-1的亞細胞分布也受細胞生長狀態的影響。

本研究結果顯示，手術組GLUT-1表達高于模型組及空白組，提示DJB手術能上調T2DM大鼠回腸組織中GLUT-1的表達水平，進而降低血糖水平。我們還發現，模型組與手術組大鼠術前伴有高胰島素血癥，存在嚴重的胰島素抵抗，而手術組術后胰島素水平降低，低于模型組，推測DJB手術可能還有糾正胰島素抵抗的作用，與調節GLUT-1表達共同達到降低血糖的效果。

總之，DJB手術可降低T2DM大鼠血糖水平，上調回腸組織中GLUT-1表達，其降糖作用可能與調節GLUT-1表達有關。

參考文獻：

[1] Dixon JB, Zimmet P, Rubino F, et al. Bariatric surgery: an IDF statement for obese Type 2 diabetes[J]. Diabete Med, 2011,28(6):628-642.

[2] 中華醫學會糖尿病學分會,中華醫學會外科學分會.手術治療糖尿病專家共識[J].中國實用外科雜志,2011,31(5):367-370.

[3] Schauer PR, Kashyap SR, Wolski K, et al. Bariatric surgery versus intensive medical therapy in obese patients with diabetes[J]. N Engl J Med , 2012,366(17):1567-1576.

[4] Mingrone G, Panunzi S, De Gaetano A, et al. Bariatric surgery versus conventional medical therapy for type 2 diabetes[J]. N Engl J Med, 2012,366(17):1577-1585.

[5] 樊健.葡萄糖轉運蛋白1與惡性腫瘤相關性的研究進展[J].中國腫瘤生物治療雜志,2010,17(2):232-136.

[6] 郝穎,柴瑞華,于世家.改良鏈脲佐菌素(STZ)誘導大鼠糖尿病模型及其飼養方法[J].中華中醫藥學刊，2008,26(4):784-785.

[7] 潘瑞艷,嚴慶濤,曲俊生,等.大網膜瓣包繞胃腸道吻合口防治糖尿病大鼠消化系吻合口漏的療效[J].世界華人消化雜志,2013,21(29):3107-3111.

[8] Leibson CL. Temporal trends in BMI among adults with diabetes[J]. Diabetes Care, 2001,24(9):1584-1589.

[9] Levy P, Fried M, Santini F, et al. The comparativeeffects of bariatric surgery on weight and type 2 diabetes[J]. Obes Surg, 2007,17(9):1248-1256．

[10] Rasmussen BA, Breen DM, Duca FA, et al. Jejunal leptin-PI3K signaling lowers glucose production[J]. Cell Metab, 2014,9(1):155-161.

[11] Francesco R, Michel G. Potential of surgery for curing type 2 diabetes mellitus[J]. Ann Surg, 2002,236(5):554-559.

[12] Li J V, Ashrafian H, Bueter M. Metabolic surgery profoundly influences gut microbial-host metabolic cross-talk[J]. Gut, 2011,60(9):1214-1223.

[13] Deng D, Xu C, Sun P, et al. Crystal structure of the human glucose transporter GLUT-1[J]. Nature, 2014,510(7503):121-125.

[14] Shetty M, Ismail-Beigi N, Loeb JN, et al． Induction of GLUT1 mRNA in response to inhibition of oxidative phosphorylation[J]. Am J Physiol, 1993,265:C1224-C1229.

[15] Kim YW, Do IG, Park YK. Expression of the GLUT1 glucose transporter, p63 and p53 in thyroid carcinomas[J]. Pathol Res Pract, 2006,202(11):759-765.