七氟醚預處理對大鼠肝缺血再灌注致肺損傷的干預作用及機制探討

七氟醚預處理對大鼠肝缺血再灌注致肺損傷的干預作用及機制探討

王曉麗1，徐桂萍2，管小萌1

(1新疆醫科大學，烏魯木齊830000；2新疆維吾爾自治區人民醫院)

摘要：目的觀察七氟醚預處理對肝缺血再灌注致肺損傷的干預作用，并探討其機制。方法健康Wistar大鼠30只，隨機分為假手術組、模型組、七氟醚組，每組10只。模型組與七氟醚組制作部分肝缺血再灌注模型，其中七氟醚造模前給予七氟醚吸入30 min；假手術組僅游離肝門，但不阻斷血供。于再灌注60 min時處死大鼠，測血清ALT、AST、TNF-α；取部分右肺上葉組織用于測算濕重與干重比值(W/D)，部分制作石蠟切片用于病理觀察；取左肺組織，測定丙二醛(MDA)及MMP-9 mRNA。結果光鏡下假手術組肺組織結構未見異常；七氟醚組肺組織損傷程度較模型組減輕。模型組、七氟醚組血清ALT、AST、TNF-α水平升高，與假手術組相比，P均<0.05；七氟醚組血清ALT、AST、TNF-α水平低于模型組(P均<0.05)。模型組、七氟醚組肺組織W/D、MDA含量及MMP-9 mRNA相對表達量均升高，與假手術組相比，P均<0.05；七氟醚組肺組織W/D、MDA含量及MMP-9 mRNA相對表達量低于模型組(P均<0.05)。結論 七氟醚可減輕肝缺血再灌注導致的肺損傷，機制可能與降低TNF-α水平、抑制MMP-9 mRNA表達等有關。

關鍵詞：七氟醚；肝缺血再灌注；肺損傷；動物實驗模型

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.39.006

中圖分類號：R971+.2 文獻標志碼：A

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81160016)。

作者簡介：第一王曉麗(1989-)，女，在讀研究生，研究方向為七氟醚的器官保護作用。E-mail： 290818040@qq.com

作者簡介：通信徐桂萍(1967-)，女，主任醫師，教授，碩士生導師，研究方向為七氟醚的器官保護作用。E-mail: XGPSYL@126.com

收稿日期：(2015-07-02)

Intervention of sevoflurane pretreatment on rat pulmonary injury caused

by liver ischemia reperfusion and its mechanism

WANGXiao-li1,XUGui-ping,GUANXiao-meng

(1XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the intervention of sevoflurane pretreatment on rat pulmonary injury caused by liver ischemia reperfusion and to explore its mechanism. MethodsA total of 30 healthy Wistar rats were randomly divided into sham-operation group, the model group and the sevoflurane group, with 10 rats in each group. Models of liver ischemia reperfusion were established in the model group and sevoflurane group, and rats of the sevoflurane group were given inhalation of sevoflurane for 30 min before modeling; while in the sham-operation group, only porta hepatis was separated but blood supply was not blocked. Rats were scarified at 60 min after reperfusion, and the serum alanine aminotransferase (ALT), aspertate aminotransferase (AST) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were detected; part of right upper lobe was used to measure the wet/dry weight ratio (W/D ratio) and part was used to make paraffin section for pathological observation; and left lung tissue was taken to determine malondialdehyde (MDA) and MMP-9 mRNA. ResultsLung tissue of the sham-operation group was normal in structure under microscopy, while damage degree of lung tissue in the sevoflurane group was reduced as compared with that of the model group. Serum ALT, AST and TNF-α of the model group and sevoflurane group were increased as compared with those of the shan-operation group (all P<0.05); while serum ALT, AST and TNF-α of the sevoflurane group was lower than that of the model group (all P<0.05). W/D ratio, MDA content and relative expression of MMP-9 mRNA in the lung tissues of the model group and sevoflurane group were increased as compared with those of the sham-operation group (all P<0.05); W/D ratio, MDA content and relative expression of MMP-9 mRNA in the lung tissues of the sevoflurane group were lower than those of the model group (all P<0.05). ConclusionSevoflurane can alleviate the pulmonary injury caused by liver ischemia reperfusion, whose mechanism may be related to the lower levels of TNF-α and inhibition of MMP-9 mRNA expression, etc.

Key words: sevoflurane; liver ischemia reperfusion; lung injury; animal experiment model

肝缺血再灌注引起的肺損傷是全身炎癥反應失衡的結果[1，2]。已有研究證實缺血再灌注的器官因組織受損可向循環中釋放細胞因子及其他促炎介質，造成多臟器功能障礙[3]。最近研究[4,5]報道，肝組織MMP-9表達與缺血再灌注損傷有關。基質金屬蛋白酶已成為多器官功能障礙的治療靶點之一[6]。七氟醚被證實能減輕臟器的缺血再灌注損傷[7~9]。2014年3~9月，本研究建立了大鼠部分肝缺血再灌注模型，并觀察了七氟醚預處理對肝缺血再灌注引起的肺損傷的干預作用。

1材料與方法

1.1實驗動物與分組健康成年雄性Wistar大鼠30只，體質量270~330 g，由新疆醫科大學實驗動物中心提供。實驗前大鼠禁食12 h，自由飲水，采用隨機數字表法分為假手術組、模型組和七氟醚組。

1.2模型制作及七氟醚用法模型組與七氟醚組參照文獻[10]方法制備70%部分肝缺血再灌注模型：以2%戊巴比妥鈉(80 mg/kg)腹腔注射麻醉，氣管切開插管，接小動物呼吸機行機械通氣；機械通氣30 min后，取上腹正中切口逐層剪開腹壁各層，游離肝臟，剪除韌帶及系膜，在肝蒂中分離出進入肝左葉及中葉的血管；經頸內靜脈注入50 U肝素5 min后，用血管夾鉗夾肝左、中葉血供造成70%肝臟缺血；阻斷30 min后松開血管夾恢復血液循環。七氟醚組造模前將呼吸機的進氣口與裝有七氟醚揮發罐的麻醉機呼吸回路末端相連，于肝門阻斷前吸入2.0%七氟醚[11]30 min，停止吸入后制備模型。假手術組僅游離肝臟但不阻斷血供。

1.3觀察方法于再灌注60 min時處死大鼠，經腹主動脈采血2 mL，測血清ALT、AST、TNF-α；取右肺上葉組織用于測算濕重與干重比值(W/D)；取右肺組織，用4%甲醛固定，制作石蠟切片用于肺組織病理觀察；取左肺組織速置于-80 ℃冰箱中保存，用于測定丙二醛(MDA)及MMP-9 mRNA。

1.3.1肺組織病理觀察取部分左肺上葉組織，4%中性甲醛固定，常規石蠟包埋，5 μm切片，HE染色，光鏡下觀察肺組織病理變化。

1.3.2血清AST、ALT、TNF-α檢測采用Olympus2700型全自動生化分析儀測定血清ALT、AST。采用雙抗體夾心ELISA法測定血清TNF-α。

1.3.3W/D測算取右肺上葉組織用生理鹽水沖洗表面血跡，用濾紙吸干表面水分稱濕重，將組織放在70 ℃電熱恒溫鼓風干燥箱中24 h后稱干重，兩者比值為W/D。

1.3.4MDA檢測取部分-80 ℃冰箱保存的左肺組織，制成10%組織勻漿，采用比色法測定MDA。

1.3.5MMP-9 mRNA檢測采用RT-PCR法。取部分-80 ℃冰箱保存的左肺組織，提取總RNA，反轉錄成cDNA，然后進行RT-PCR反應。MMP-9上游引物序列為5′-CCCTGCGTATTTCCATTCATC-3′，下游引物序列為5′-AACCATCCGAGCGACCTTT-3′，產物長度73 bp；內參β-actin上游引物序列為5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′，下游引物序列為5′-AGCCACCAATCCACACAGAG-3′，產物長度163 bp。取PCR產物5 μL于2%瓊脂糖凝膠進行電泳，用凝膠圖像分析系統掃描測定PCR擴增條帶的吸光度值，以MMP-9條帶吸光度值與β-actin條帶吸光度值之比表示MMP-9 mRNA相對表達量。

1.4統計學方法采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以±s表示，組間、組內比較采用單因素方差分析。P<0．05為差異有統計學意義。

2結果

2.1三組肺組織病理變化光鏡下假手術組肺組織結構未見異常；模型組肺間質增生，肺泡壁增厚，肺泡上皮細胞增多，肺泡壁毛細血管明顯擴張充血，肺泡壁及肺泡間質中可見大量中性粒細胞；七氟醚組肺損傷較模型組減輕，但仍可見肺間質不同程度增生，肺泡壁毛細血管充血，肺間質炎癥細胞浸潤，肺泡結構仍受到損傷。模型組及七氟醚組隨灌注時間延長，肺組織損傷程度逐漸加重。

2.2三組血清AST、ALT、TNF-α水平比較模型組、七氟醚組血清ALT、AST、TNF-α水平升高，與假手術組相比，P均<0.05；七氟醚組血清ALT、AST、TNF-α水平低于模型組(P均<0.05)。見表1。

表1　三組血清AST、ALT、TNF-α水平比較( ± s)

表1　三組血清AST、ALT、TNF-α水平比較( ± s)

組別ALT(U/L)AST(U/L)TNF-α(ng/mL)假手術組29±9.3037±6.714.07±0.13模型組655±52.06*693±75.56*5.36±0.28*七氟醚組464±47.71*#516±78.84*#4.45±0.25*#

注：與假手術組相比，*P<0.05 ；與模型組相比，#P<0.05。

2.3三組肺組織W/D、MDA含量及MMP-9 mRNA相對表達量比較模型組、七氟醚組肺組織W/D、MDA含量及MMP-9 mRNA相對表達量均升高，與假手術組相比，P均<0.05；七氟醚組肺組織W/D、MDA含量及MMP-9 mRNA相對表達量低于模型組(P均<0.05)。見表2。

表2　 三組肺組織W/D、MDA含量及MMP-9 mRNA

相對表達量比較( ± s)

表2　 三組肺組織W/D、MDA含量及MMP-9 mRNA

組別W/D(%)MDA(nmol/mg)MMP-9mRNA假手術組3.51±0.320.53±0.100.84±0.66模型組4.70±0.43*0.88±0.18*3.95±0.13*七氟醚組4.43±0.24*#0.74±0.12*#3.46±0.15*#

注：與假手術組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

3討論

目前，單器官缺血再灌注引起多器官功能障礙的機制尚未明確，現已知氧毒性及自由基產物等在其進展過程中發揮重要作用[12]。研究[13]表明，損傷的肝組織向循環內釋放促炎細胞因子和氧自由基是引起遠隔臟器損傷的原因，其中以肺功能障礙多見。七氟醚麻醉誘導迅速，維持平穩，蘇醒快速、完全，目前證實其可減輕缺血再灌注肝損傷，作用可能是減少自由基生成、減輕膜脂質過氧化反應等。ALT、AST為肝功能指標，本研究發現，七氟醚組血清ALT、AST水平高于假手術組，但低于模型組，表明七氟醚預處理可減輕缺血再灌注引起的肝細胞損傷，與相關研究結果一致。

MDA是氧自由基與生物膜中不飽和脂肪酸作用的產物，MDA可反映氧自由基水平及脂質過氧化反應程度。相關研究[6]表明，TNF-α作為炎癥因子，可協同IL-1β、IL-8等激活MMPs降解細胞外基質，參與肝損傷及肺損傷中細胞外基質的退化過程[14]。MMP-9是MMPs家族中的一員，在肝缺血再灌注所致肺損傷組織中，MMP-9活性增加[5，15]，故檢測TNF-α及MMP-9可反映缺血再灌注肝損傷及肺損傷的情況。本研究結果顯示，模型組及七氟醚組大鼠肺組織有病理改變，其中七氟醚組程度較輕；七氟醚組肺組織W/D高于模型組，表明七氟醚處理后大鼠毛細血管通透性得到改善。模型組、七氟醚組MDA含量及MMP-9 mRNA相對表達量均較假手術組升高，其中七氟醚組肺組織W/D、MDA含量及MMP-9 mRNA相對表達量低于模型組，提示七氟醚對肺損傷的干預作用機制可能與降低TNF-α水平、下調MMP-9 mRNA表達等有關，具體機制仍有待于深入研究。

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