新生兒窒息后血清對人腎近曲小管上皮細胞線粒體膜通透性的影響

新生兒窒息后血清對人腎近曲小管上皮細胞線粒體膜通透性的影響*

趙婧1董文斌1李鵬云3王明勇2鄧存良2許開桂1

(四川醫科大學附屬醫院 1.新生兒科,2.傳染與免疫研究室, 3.四川醫科大學心肌電生理學研究室, 四川 瀘州 64600)

【摘要】目的研究新生兒窒息后血清對人腎近曲小管上皮細胞(HK-2)線粒體膜通透性的影響。方法以人腎近曲小管上皮細胞(HK-2)為研究對象，實驗共分為: 正常對照組、窒息組和吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)干預組。以20%窒息后24小時血清作為攻擊濃度。用四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(JC-1)檢測HK-2細胞線粒體膜電位變化；Western blot測HK-2細胞內線粒體中CytC的釋放情況。結果①經窒息血清攻擊后HK-2細胞線粒體膜紅/綠熒光強度比值(590/530nm)明顯降低(P<0.01)，但有了PDTC干預，HK-2細胞線粒體膜紅/綠熒光強度比值明顯升高(P<0.01)。②正常組HK-2細胞的胞漿中不含細胞色素C，主要存在于線粒體內，窒息組胞漿中細胞色素C從線粒體漏出較對照組明顯增加，相應的在線粒體內表達減少，差異有統計學意義(P<0.05)；PDTC干預組胞漿中細胞色素C表達也有所增加，但大部分仍位于線粒體內，與窒息組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。結論新生兒窒息后血清可影響人HK-2細胞線粒體膜通透性，使線粒體膜電位下降，膜間隙蛋白如細胞色素C等漏出。其胞內信號機制涉及到NF-κB活化。

【關鍵詞】嬰兒； 新生； 窒息； 凋亡； 線粒體； 核因子-κB；腎損傷

【中圖分類號】R 722.12【文獻標志碼】A

基金項目：四川省杰出青年學科帶頭人培養基金(04ZQ026-033);四川省科技廳應用基礎項目(2008JY0015)

通訊作者：董文斌，教授，E-mail: dongwenbin2000@163.com

收稿日期：( 2015-01-19； 編輯： 張文秀)

Effect of postasphyxial-serum in neonate on the mitochondria membrane permeability in renal tubular cellsZHAO Jing1,DONG Wenbin1,LI Pengyun2,etal

(1.DepartmentofNewbornMedicine，Luzhou646000,Sichuan,China; 2.LaboratoryofInfectionandImmunity,

TheAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege，Luzhou646000,Sichuan,China; 3.InstituteofMyocardium

Electrophysiology,SichuanMedicalUniversity,Luzhou646000,Sichuan,China)

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of postasphyxial-serum in neonate on the mitochondria membrane permeability in renal tubular cells. MethodsHuman renal proximal tubular cell line HK-2 cell was used as target cell, which was divided into control group, asphyxia group and pyrrolodine dithiocarbamate (PDTC) blocking group. The attacking concentration of serum was 20%. The mitochondria membrane potential was detected by 5,5,6,6 -tetrachloro-1,1,3,3 -tetraethyl benzimidazolyl carbocyanine iodide(JC-1), and the release of the apoptogenic mitochondrial proteins cytochrome C was assessed by Western Blot.ResultsThe red/green fluorescence light intensity ratio of mitochondria membrane potential(590/530nm) in asphyxia group and PDTC blocking group were significantly lower than that in normal control group(P<0.01). The red/green fluorescence light intensity ratio of mitochondria membrane potential(590/530nm)in PDTC blocking group was significantly increased(P<0.01) compared with that of other groups. Cytochrome C was not present in the cytosolic fraction of normal cells. Increasing amounts of cytochrome C were detected in the cytosol of postasphyxial-serum treated cells, with a concomitant decrease of cytochrome C in the mitochondrial fraction(P<0.05). In contrast, no significant release of cytochrome C into the cytosol or change in the amount of cytochrome C in the mitochondrial fraction was detected in PDTC-treated cells(P<0.05).ConclusionThese data demonstrates that postasphyxial-serum is a stimulus, which can decrease the mitochondria membrane potential in human renal tubular cells and along with the release of cytochrome C from mitochondria to cytosol. It's intracellular signal transduction mechanism is presumably involved in the activation of nuclear factor-κB (NF-κB).

【Key words】Infant, Neonate; Asphyxia; Apoptosis; Mitochondria; Nuclear factor-κB; Renal injury

新生兒窒息可以導致多器官功能的損傷，腎損傷的發病率最高，其中腎小管又是腎損傷發生最早的部位[1]，而凋亡作為其損傷的一種形式已得到證實[2,3]。線粒體作為真核細胞內的"能量工廠"，其狀態決定細胞死亡的類型。不同凋亡途徑都是通過作用于線粒體膜來決定凋亡是否發生。線粒體膜電位的下降被認為是凋亡的早期事件[4]。線粒體膜通透性發生改變后還可能使膜間隙中的凋亡蛋白釋放，細胞進入不可逆凋亡過程。但在窒息后腎小管損傷中是否發生線粒體膜通透性的改變及其發生機制如何，尚不明確。因此，本研究以人近曲腎小管上皮細胞(HK-2)為研究對象，探討新生兒窒息后血清對HK-2細胞線粒體膜電位的影響及膜間隙蛋白釋放情況，旨在探索窒息后腎細胞凋亡的發生機制，為探索新的防治方法提供實驗依據。

1材料與方法

1.1材料及試劑人HK-2引自ATCC(American Type Culture Collection);DMEM培養基(GIBCO)；胰酶(美國sigma公司)；胎牛血清(成都雅信科技公司)；吡咯烷二硫氨基甲酸-PDTC(美國sigma公司)；線粒體膜電位檢測試劑盒(Biovision)；兔抗人cytochrome C多克隆抗體(美國CST公司)。其余試劑均為市售分析純。

1.2新生兒窒息后血清的制備[2]選擇2007年1～4月在我科住院的足月重度室息新生兒，且均未使用免疫抑制制劑、無明顯感染性疾病。在窒息后24h抽取外周血5 mL(肝素抗凝)，2500 r/min離心10min，分離血清，56℃ 水浴30 min滅活補體，微孔濾器過濾除菌，采用DMEM培養液配成20%(體積比，v/v)的攻擊濃度待用。

1.3實驗分組用質量分數為10%的胎牛血清的DMEM培養基培養HK-2。實驗分為正常對照組、窒息組和吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)干預組。先在六孔板內平放消毒蓋玻片(20mm×20mm),根據分組，將已生長至約80%匯合的細胞在培養瓶中消化成單個細胞，計數后按每孔80000個細胞接種在蓋玻片上，加培養液至2ml。待細胞完全貼壁后，均于實驗前12小時換液使細胞生長繁殖同步，于37℃，5%CO2條件下進行如下處理：①窒息組:每組培養液換成含20%窒息后血清的DMEM培養液。②PDTC干預組:每組培養液換成含20%窒息血清的DMEM培養液后，同時加40 μmol/L PDTC。③正常對照組:每組培養液換成不含窒息血清的DMEM 培養液，上述培養體系其余培養條件完全一致，在37℃、5%CO2的條件下培養24 h后，觀察損傷指標。

1.4檢測線粒體膜電位(△ψm)的變化待測細胞培養液換成含終濃度為0.5μM JC-l DMEM培養基，37℃ 、5%CO2避光孵育20min，再用1ml預熱的緩沖液漂洗一次。置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。設置激發波長為 488nm，發射波長為530nm及590nm分別觀察綠色和紅色熒光。計算機采集圖像熒光值，計算紅/綠熒光強度比值。

1.5凋亡蛋白-CytC的釋放用胰酶細胞消化液(Trypsin-EDTA Solution)消化細胞后離心收集細胞(4×107個)，用臨用前添加了1mM PMSF的線粒體分離試劑輕輕重懸細胞沉淀，冰浴放置10～15 min。然后將細胞懸液轉移到2ml的玻璃勻漿器中，勻漿40下(臺盼藍染色，鑒定勻漿效果)。把細胞勻漿在 600g，4℃離心10 min。轉移上清到另一1.5ml離心管中，在11,000g，4℃離心10min。吸取上清并儲存在-80℃下(胞漿部分)；余下的沉淀用臨用前添加了1mM PMSF的線粒體裂解液裂解，裂解后的樣品即為線粒體蛋白。用BCA法測定蛋白濃度。取50μg蛋白用于Western blot試驗：10%SDS-PAGE電泳，轉膜，BSA37℃封閉1h，加入一抗，4℃過夜，漂洗三次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，加入ECL試劑，X線膠片曝光成像。

2結果

2.1窒息后血清導致HK-2細胞線粒體膜電位變化情況JC-1是一種能夠滲透到細胞器內并且特異性與細胞中線粒體結合的陽離子染料，是目前被認為檢測線粒體膜電位最好的熒光染劑。在線粒體膜電位低時以單體存在，呈綠色熒光(530nm)；而在正常細胞JC-1以多聚體形式存在，發出明亮的紅色熒光(590nm)。各組HK-2 細胞內線粒體膜電位在不同波長熒光激發下強度變化見圖1?？梢钥闯?，在590nm發散波長下，JC-1在對照組HK-2細胞中以多聚體形式存在于線粒體內，發出明亮的紅色熒光，有少量以單體形式存在于胞質內，在530nm發散波長下發出淺綠色熒光，兩張圖片疊加后呈現橙色熒光；窒息組HK-2細胞紅色熒光明顯變淡，說明線粒體膜電位被去極化，JC-1不能在線粒體內聚集，而在胞質內呈現亮綠色熒光，兩張圖片疊加后呈現黃綠色熒光；JC-1能在PDTC干預組HK-2細胞線粒體內聚集，并發出紅色熒光，少部分存在于胞質內，發出綠色熒光，兩張圖片疊加后呈現黃色熒光。

可以根據紅/綠熒光強度比值來標志線粒體膜電位的喪失[5,6]。應用激光掃描共聚焦顯微鏡半定量檢測細胞內線粒體JC-1熒光強度顯示,窒息組和PDTC干預組細胞線粒體膜紅/綠熒光強度比值組(590/530nm)明顯低于正常對照組，差異具有統計學意義(P<0.01)。但與窒息組相比，PDTC干預組細胞線粒體膜紅/綠熒光強度比值明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。

Table 1　JC-1 fluorescence ratios

注：F=68.558。①與對照組比較，P值為0.000；②與窒息組比較，P值為0.000。

2.2窒息后血清誘導HK-2細胞內細胞色素C胞漿轉位目的條帶位于分子量14KDa處，用Quantity One分析軟件進行光密度(optical density，OD)分析。對照組HK-2細胞的胞漿中不含細胞色素C，主要存在于線粒體內；窒息組細胞胞漿中細胞色素C從線粒體漏出較對照組明顯增加，相應的在線粒體內表達減少，差異有統計學意義(P<0.05)；PDTC干預組胞漿中細胞色素C表達也有所增加，但大部分仍位于線粒體內，與窒息組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2，圖2。

圖1窒息后血清導致HK-2細胞線粒體膜電位變化情況 (激光共聚焦顯微鏡×400)

Figure 1　The membrane potential of mitochondria

注：F胞漿/線粒體=16.458；①與對照組比較，P胞漿/線粒體值為0.011；②與窒息組比較，P胞漿/線粒體值為0.034。

圖2窒息后血清誘導HK-2細胞內細胞色素C胞漿轉位

Figure 2The release of cytochrome C from mitochondria after postasphyxial-serum challenge

注：(a)胞漿內細胞色素C； (b)線粒體內細胞色素C

3討論

線粒體是細胞進行呼吸、電子傳遞、三羧酸循環和氧化磷酸化的重要場所。由于線粒體內外兩層單位膜不同的選擇通透性，當電子在線粒體內膜電子鏈上傳遞的同時，伴隨H 由基質內通過質子泵泵出到膜間腔，形成跨線粒體內膜電化學質子梯度(△ψm)?！鳓譵對維持線粒體的正常功能是必要的。在神經細胞缺血再灌注損傷所致的細胞凋亡中可以觀察到線粒體膜電位(△ψm)的下降[7]，一旦線粒體膜電位完全耗散，細胞就將進入不可逆凋亡過程，最終引起細胞死亡。

新生兒窒息復蘇后的過程實際上是缺血再灌注過程，在此過程中機體可產生多種細胞因子、炎癥介質及大量氧自由基，爆發全身炎癥反應綜合癥(SIRS)[8,9]，對窒息發病及腎損傷的發生起重要作用。而窒息后腎損傷發生的高峰在24h內[10]，因此本研究采用窒息后1d的血清來攻擊HK-2細胞，造成細胞損傷模型。本研究在前期實驗證實凋亡是窒息后腎損傷的一種形式的基礎上[2]，進一步研究線粒體膜通透性變化在窒息后腎損傷的作用。結果發現，新生兒窒息后血清可誘導HK-2細胞線粒體膜電位下降，使膜間隙蛋白漏出，證明線粒體的功能紊亂可能參與了窒息后血清所致的細胞凋亡。

已知NF-κB是一種信號傳遞分子，作為細胞內具有多向轉錄調節作用的核蛋白因子，在炎癥反應、氧化應激、細胞增生和凋亡中發揮重要作用[11～13]。也已證實腎小管細胞凋亡的機制牽涉到NF-κB的活化[2]。而本研究在培養體系中加入NF-κB特異性抑制劑PDTC后，可以反轉窒息后血清導致的線粒體膜電位下降和阻止細胞色素C釋放。進一步證實了NF-κB活化參與的窒息后血清誘導的細胞凋亡可能通過作用于線粒體來介導。其可能的機制牽涉到線粒體內膜非特異性通透性孔道(Mitochondrial Permeability Transition Pore, MPTP)的持續開放和Bcl-2蛋白家族的協同作用[14]。

MPTP是由電位依賴性陰離子通道(VDAC)、腺甘酸移位酶(ANT)及親環素D(Cyp-D)復合物在內外膜交界處構成的一種復合結構[15]。MPTP周期性開放，以維持線粒體內外電化學平穩及穩定狀態。研究表明，許多因素可誘導PT孔開放，如促凋亡第二信使Ca 、強氧化劑、NO、神經酰胺、炎癥介質和caspase等[16]。而在窒息條件下機體產生大量炎癥介質及氧自由基，除了直接參于缺血缺氧性損傷外，這些損傷因子還可能使MPTP持續性開放，形成大的不可逆性的質子流[17]；同時炎癥介質還能激活細胞漿內處于無活性狀態的NF-κB，使其轉位于胞核，進一步上調炎癥應答因子，相互形成不斷放大的循環過程。激活的NF-κB還能上調Bcl-2家族促凋亡蛋白的表達， Bax與VDAC相互協同作用后有利于MPTP持續開放[18]。這些均使線粒體膜電位下降、耗散，線粒體腫脹，外膜破裂。進而膜間隙蛋白細胞色素C漏出，細胞色素C一旦進入細胞漿，在ATP或dATP的參與下，與凋亡蛋白水解酶激活因子1(apoptosis protease activation factor-1，Apaf-1)及caspase-9共同組成凋亡體(apoptosome)。激活caspase-9，從而啟動細胞凋亡蛋白酶級聯反應[19]。激活的caspase-9再活化caspase-3，caspase-7，作用于底物蛋白Lamin(核纖層蛋白)、DNA破碎因子、CAD(caspase activated DNAase)多聚腺苷二磷酸核糖聚合物酶(PARP)、ACINUS(apoptotic chromatin condensation inducer in the nucleus)甾體激素反應元件結合蛋白(CRED-1，2)等，繼而引起細胞核濃縮及DNA裂解，最終導致細胞凋亡。活化的Caspase還能夠加重線粒體膜電位的耗散，在這些相互聯系、不斷放大的機制作用下，將最終導致HK-2細胞進入不可逆凋亡過程。

4結論

本研究證實了凋亡的線粒體途徑參與了窒息后血清誘導的HK-2細胞凋亡。其機制涉及到線粒體膜通透性改變，提示穩定線粒體膜功能，切斷凋亡級鏈反應中的上游環節可能會減輕窒息后腎損傷的發生。

【參考文獻】

[1]呂亞芳.新生兒窒息后腎受累的實驗室指標選擇與分析[J].實用醫學雜志，2005, 21(3)：245-246.

[2]董文斌，曹敏，王明勇，等．新生兒窒息后血清誘導人腎小管細胞凋亡的作用[J]．實用兒科臨床雜志，2005，20(12)：1207-1209.

[3]趙婧，董文斌，李鵬云，等.新生兒窒息后血清對人腎小管細胞抗Bcl-2蛋白、Bcl-2聯接X蛋白表達的影響[J].實用兒科臨床雜志，2008,23(2)：119-123.

[4]van Ginkel PR, Darjatmoko SR, Sareen D,etal. Resveratrol inhibits uveal melanoma tumor growth via early mitochondrial dysfunction[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2008,49(4):1299-1306.

[5]張杰,劉禎,景鵬, 等.細胞線粒體膜電位的測量方法[J].首都醫科大學學報,2006,27(1):124-125.

[6]Kasahara E,Lin L,Ho Y,etal.Manganese Superoxide Dismutase Protects against Oxidation-Induced Apoptosis in Mouse Retinal Pigment Epithelium:Implications for Age-Related Macular Degeneration[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,2005,46(9):3426-3434.

[7]HAN Yi-xiang，ZHANG Sheng-hui，WANG Xi-ming，etal.Inhibition of mitochondria responsible for the anti-apoptotic effects of melatonin during ischemia-reperfusion[J], Zhejiang Univ SCIENCE B,2006,7(2):142-147.

[8]董文斌，唐章華，陳紅英，等 ．窒息新生兒尿中炎癥細胞因子改變與腎小管損傷的關系[J]. 中國危重病急救醫學，2003，15(2)：94-96.

[9]Saba H,Batinic-Haberle I,Munusamy S,etal.Manganese Porphyrin Reduces Renal Injury and Mitochondrial Damage during Ischemia/Reperfusion[J].Free Radic Biol Med,2007, 42(10): 1571-1578.

[10] 董文斌,曹敏,王明勇,等.新生兒窒息后血清在誘導人腎小管細胞損傷中的作用[J].實用兒科臨床雜志,2006,21(17):1135-1138.

[11] Amin M,Haas C,Zhu K,etal.Migration inhibitory factor up-regulates vascular cell adhesion molecule-1 and intercellular adhesion molecule-1 via Src, PI3 kinase, and NFκB[J].Blood,2006,107(6):2252-2261.

[12] Piotrowska A, Izykowska I, Podhorska-Okoów M,etal.The structure of NF- kappaB family proteins and their role in apoptosis[J]. Postepy Hig Med Dosw (Online),2008,15(62):64-74.

[13] Sethi G, Sung B, Aggarwal BB. Nuclear factor-kappaB activation: from bench to bedside[J]. Exp Biol Med,2008,233(1):21-31.

[14] Han YX, Zhang SH, Wang XM,etal.Inhibition of mitochondria responsible for the anti-apoptotic effects of melatonin during ischemia-reperfusion[J]. Zhejiang Univ Sci B, 2006,7(2): 142-147.

[15] Kroemer G, Galluzzi L, Brenner C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death[J].Physiological reviews, 2007,87(1):31-33.

[16] Müller A, Günther D, Brinkmann V,etal. Targeting of the pro-apoptotic VDAC-like porin (PorB) of Neisseria gonorrhoeae to mitochondria of infected cells[J]. EMBO J, 2000,19(20): 5332-5343.

[17] Nadtochiy S, Tompkins A, Brookes P.Different mechanisms of mitochondrial proton leak in ischaemia/reperfusion injury and preconditioning: implications for pathology and cardioprotection[J]. Biochem J,2006,395(Pt 3): 611-618.

[18] Tan KO, Fu NY, Sukumaran SK,etal.MAP-1 is a mitochondrial effector of Bax[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(41): 14623-14628.

[19] Logue SE, Martin SJ. Caspase activation cascades in apoptosis[J]. Biochemical Society Transactions,2008,36(pt1):1-9.