新疆維吾爾族與漢族Graves病患者血清IL-17水平及其基因多態性研究

新疆維吾爾族與漢族Graves病患者血清IL-17水平及其基因多態性研究

黃玫1,2， 王巖2， 樊勇1

(1新疆醫科大學第一附屬醫院內分泌科, 烏魯木齊830054;2新疆昌吉州人民醫院內分泌科,新疆昌吉831100)

摘要：目的探討維吾爾族(簡稱維族)與漢族Graves病(GD)患者血清白細胞介素17(IL-17)與IL-17rs763780基因多態性的差異及其與CD之間的關系。方法選擇初發、未經治療的GD患者193例(GD組，維族99例，漢族94例)及健康體檢者188例(健康對照組，維族97例，漢族91例)，應用酶聯免疫吸附法檢測血清IL-17水平。用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析方法(PCR-RFLP)測定IL-17rs763780基因多態性。結果與健康對照組比較，GD組血清IL-17水平明顯升高，差異有統計學意義；維族GD患者血清IL-17水平較漢族GD患者明顯升高，差異有統計學意義。GD組血清IL-17水平與TRAb、FT3、FT4呈正相關(r=0.139， P<0.05；r=0.159， P<0.05；r=0.047， P<0.01)。與健康對照組比較，GD組IL-17rs763780等位基因T分布高于等位基因C，差異有統計學意義。與健康對照組比較，GD患者IL-17rs763780位點TT分布高于TC、CC基因型，差異有統計學意義(P<0.05)。與漢族GD組比較，維族GD患者IL-17rs763780等位基因C和T分布比較差異無統計學意義；維族GD患者與漢族GD患者IL-17rs763780位點 CC、TC、TT基因型分布比較差異無統計學意義(P>0.05)。GD組3種不同基因型(CC、TC、TT)血清IL-17水平有差異。結論IL-17在GD中的高表達提示其與可能與GD的發病相關；IL-17rs763780基因多態性可能與IL-17水平有關。

關鍵詞：Graves病； 白細胞介素17； 單核苷酸多態性； 漢族； 維吾爾族

中圖分類號：R581文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.04.011

[收稿日期：2014-08-06]

Study of IL-17 gene polymorphism with Graves patients on

Uyghur and Han in Xinjiang

HUANG Mei1， WANG Yan2， FAN Yong1

(1DepartmentofEndocrinology,TheFirstAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830054,China;2DepartmentofEndocrinology,ThePeople′sHospitalofChangji

HuiAutonomousPrefecture,Changji831100,China)

Abstract：ObjectiveTo explore the differences of serum interleukin-17 (IL-17) and IL-17 rs763780 gene polymorphism between Uyghur and Han GD patients, and the relationship with Graves disease (GD). MethodsChoose the incipient, 193 patients was untreated GD (GD group, 99 of Uyghur and Han, 94 cases) and 188 cases of healthy physical examination(healthy control group, 97 cases Uyghur and han, 91 cases), using enzyme-linked immunosorbent method to detect the serum level of IL-17. Using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis method (PCR-RFLP) determination of IL-17 rs763780 gene polymorphism. ResultsGD group compared with control group, the serum IL-17 level increased significantly, the difference was statistically significant, Uyghur compared with Han patients with GD, GD patients serum levels of IL-17 Uyghur patients increased significantly , the difference was statistically significant. In the hyperthyroidism group, the serum level of IL-17 and TRAb, FT3, FT4 were positively correlated (r=0.139， P<0.05；r=0.159， P<0.05；r=0.047， P<0.01). Compared with healthy controls, patients with GD group of IL-17 rs763780 allele T distribution is higher than the distribution of allele C, the difference was statistically significant. Compared with healthy controls, patients with GD IL-17 rs763780 loci TT genotype distribution above TC, CC genotype, the difference was statistically significant (P<0.05). To compared with the Han GD group, there was no statistically significant difference in Uyghur GD group of IL-17 rs763780 allele C and T distribution; Uyghur GD patients compared with Han GD patients , there was no statistically significant difference in genotype distribution of IL-17 rs763780 loci CC, TC, TT (P>0.05). GD group 3 different genotypes (CC, TC, TT) between the serum level of IL-17. ConclusionHigh expression of IL-17 in GD prompt its and may be associated with the onset of GD; IL-17 rs763780 gene polymorphism may be related to the level of IL-17.

Key words: hyperthyroidism； interleukin 17； single nucleotide polymorphisms； the Han nationality； the Uyghur

甲狀腺功能亢進癥(簡稱甲亢)是甲狀腺腺體本身產生甲狀腺激素過多而引起的甲狀腺的毒癥。其中以Graves病(GD)最為常見，占所有甲亢的85%左右，其發病機制復雜, 是一種涉及細胞和體液免疫紊亂的自身免疫性疾病。該病患者甲狀腺功能明顯異常，血清甲狀腺激素水平明顯升高，促甲狀腺激素水平降低。近年來國內外有研究顯示白細胞介素17 (IL-17)與Graves病的發病有一定相關性[1-2]。有研究報道IL-17與中國漢族人群Graves病發病有關[3-4]，但缺乏少數民族與IL-17及其基因多態性的相關研究。本研究主要探討漢族與維吾爾族(維族)GD患者IL-17水平的差異與IL-17rs763780基因多態性及其與GD的相關性。

1資料與方法

1.1臨床資料選擇2013年9月-2014年3月在新疆醫科大學第一附屬醫院內分泌科門診就診的新確診未經任何治療的GD患者193例(GD組)，維族99例，漢族94例，男性43例，女性150例，年齡13～72歲，平均(36.6±12.5)歲。患者收入診斷標準依據中華醫學會內分泌學分會制定的《甲狀腺機能亢進癥臨床診斷標準》和《Graves病的診斷標準》。排除合并其他自身免疫性疾病、急性感染、慢性阻塞性肺疾病、腫瘤及既往有甲狀腺疾病史患者。另從健康體檢中心隨機選取選取188例(維族97例，漢族91例)健康體檢者(排除既往有甲狀腺疾病史及有甲狀腺相關疾病家族史者)作為健康對照組，其中男性40例，女性148例，年齡16～72歲，平均(37.9±12.4)歲。兩組性別及年齡比較差異無統計學意義。所有標本甲狀腺功能采用羅氏試劑盒測試。本研究通過新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會審查(審批號為20131011-05)，受試對象均已簽署知情同意書。GD組甲功均異常，三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、血清游離甲狀腺素(FT4)、促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)均升高，超敏促甲狀腺激素(s-TSH)降低；健康對照組甲功正常。受試對象甲狀腺功能資料見表1。

表1　受試對象甲狀腺功能資料( ±s)

1.2方法

1.2.1測定血清IL-17水平用BD促凝管取外周血3 mL，3 000 r/min離心5 min，取血清置于-20℃保存，1個月內測定。應用酶聯試劑盒(湖北伊萊瑞特生物科技有限公司)、酶標儀(PHOMO型，鄭州安圖)測定血清IL-17水平。

1.2.2基因多態性檢測取外周靜脈EDTA抗凝血600 μL，應用血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA(TIANGEN，中國北京，按說明書操作)，置于-20℃保存。根據文獻[5]設計細胞因子IL-17rs763780引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。上游引物：5′GGAATGCAAACAAACACCTG3′；下游引物：5′GTTCCCATCCAGCAAGAGAC3′。用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)進行基因型分型。首先進行PCR擴增：(1)擴增體系：反應總體積為20 μL，模板DNA 2 μL，上下游引物各0.5 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。(2)反應條件：95℃預變性3 min，然后以94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s共進行35個循環，72℃延伸5 min，4℃退火。(3)電泳：取5 μL PCR產物在溴化己啶染色1%瓊脂糖凝膠中電泳25 min，目的片段為407 bp，擴增成功。其次對目的片段進行限制性酶切：(1)酶切反應體系：反應總體積為30 μL ，其中包括PCR純化產物5 μL，內切酶FastDigest NIaⅢ 0.5 μL 10×Buffer 2 μL，去離子水22.5 μL。(2)酶切反應條件：37℃水浴5 min。最后進行基因分型：取10 μL酶切產物在溴化己啶染色1.2%瓊脂糖凝膠中電泳25 min，觀察并記錄結果。抽樣PCR擴增產物送上海生工生物工程股份有限公司進行基因測序，進一步驗證目的片段。

2結果

2.1IL-17水平比較

2.1.1GD組與健康對照組血清IL-17水平的比較GD組血清IL-17水平為(441.98±139.37) pg/mL，較健康對照組的(181.69±49.79) pg/mL明顯升高，差異有統計學意義(t′=24.87，P<0.05)。

2.1.2GD組內漢族與維族患者血清IL-17水平的比較維族GD患者血清IL-17水平為(473.35±125.48) pg/mL，較漢族患者(410.60±145.99) pg/mL明顯增高，差異有統計學意義(t=3.26，P=0.001)。

2.2相關性分析在GD患者中，IL-17水平與TRAb、FT3、FT4呈正相關(r=0.139， P<0.05；r=0.159， P<0.05；r=0.047， P<0.01)。

2.3基因分型經PCR擴增后可獲得407 bp大小的目的片段，限制性內切酶NIaⅢ能特異識別CATG序列，當IL-17rs763780位點T基因突變為C時，則產生酶切位點，37℃水浴5 min后消化生成290 bp和117 bp 2個片段。經瓊脂糖凝膠電泳后能分別觀察到407、290、117 bp 3種條帶(圖1)。抽樣PCR擴增產物進行基因測序(圖2)。

1、8為純合子TT型，5、7為純合子CC型，2、3、4、6為雜合子TC型

圖1IL-17rs763780基因多態性PCR產物酶切電泳圖

圖2　IL-17rs763780基因多態性測序結果

2.3.1IL-17rs763780等位基因及基因型分布與健康對照組相比，IL-17rs763780等位基因T分布高于等位基因C，差異有統計學意義。與健康對照相比，GD組患者IL-17rs763780位點TT基因型分布高于TC、CC基因型，差異有統計學意義(P<0.05)。維族GD患者與漢族GD患者IL-17rs763780等位基因C和T分布比較差異無統計學意義；與漢族患者相比，維族患者IL-17rs763780位點 CC、TC、TT基因型分布比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3.2不同基因型之間血清IL-17水平的比較GD患者CC、TC、TT型3種基因型之間血清IL-17水平比較差異有統計學意義(F=5.136，P=0.007)；TC、TT、CC型3種基因型兩兩比較，TC型IL-17水平高于CC型，TT型IL-17水平高于CC型，差異有統計學意義(P=0.009， P=0.002)；TC型與TT型比較，差異無統計學意義(P=0.352)。

3討論

GD的病因較為復雜，是各種不同環境、基因、內源性和局部因素等多因素相互作用的結果。目前遺傳背景被認為是GD發病過程中的重要因素。流行病學調查證實，GD發病有著明顯的遺傳傾向[6]。丹麥一項對8 699對雙胞胎的調查研究表明，在單卵雙胞胎中，2人均患GD的概率為35%，而在雙卵雙胎中，2人共患GD的概率僅為3%[7]。根據遺傳模型的統計結果，得出如下結論：在GD的各種致病因素中，遺傳因素占79%，環境和激素等其他因素占21%。GD并不遵守孟德爾遺傳定律，是許多微效基因和外界環境因素相互作用的復雜結果，是一種涉及多個基因遺傳的復雜疾病，單個基因的突變對其沒有明顯的作用，多個基因單核苷酸多態性(SNPs)的聯合作用才有可能導致其易感性的改變。

表2　GD組與健康對照組、維族GD與漢族GD患者IL-17rs763780等位基因分布與基因型分布/例(%)

近年來研究發現，Th17細胞是一類新的CD4+T輔助細胞，在防御胞外細菌感染、介導慢性炎性反應以及自身免疫性疾病中發揮了重要作用[8]。IL-17是Th17細胞分泌的特征性細胞因子。IL-17在1995年被發現時，被認為是不重要的，因其對B細胞和T細胞的功能缺乏直接的影響。而現在因其在誘導炎癥方面的強大功能而越來越受到重視[9]。許多研究表明，Th17細胞在自身免疫性疾病中發揮重要的調節作用，在許多自身免疫疾病及相應動物模型的血清及組織中均能檢測到IL-17的高表達[10]。國內已有研究顯示，IL-17水平在自身免疫性甲狀腺疾病中明顯升高[11]。本研究探討IL-17及其基因多態性與GD的關系，旨在為GD的治療提供新的治療策略。

本研究發現， GD組血清IL-17水平顯著高于健康對照組，與已有研究結論相符[12-13]，表明IL-17高水平表達在GD的發生中具有重要作用。本研究首次發現維吾爾族、漢族GD患者的IL-17水平存在差異，提示GD的發病可能與民族有關。在GD組和健康對照組中，均存在CC、TC、TT 3種基因型，與健康對照組比較，GD組3種基因型及等位基因頻率分布差異均有統計學意義(P<0.05)，提示IL-17rs763780基因多態性可能與GD的發病相關。維族與漢族GD患者IL-17rs763780基因多態性在等位基因頻率及基因型分布上尚未發現明顯差異。本研究進一步驗證了血清IL-17水平與甲亢患者FT3、FT4呈正相關，并發現GD患者TRAb與IL-17水平也呈正相關，此結果與陳紫君等[1]的研究結論IL-17與TRAb無相關性不同。同時，本研究發現，GD組3種不同基因型之間血清IL-17水平有差異； TC與TT基因型血清IL-17水平均明顯高于CC基因型患者(P<0.01)，TC與TT基因型血清IL-17水平差異無統計學意義(P>0.05)，提示在GD中，可能主要是TC和TT基因型促使IL-17高表達，成為GD發病的一個危險因素。

分析基因多態性與GD遺傳易感性之間的關系對從遺傳學角度探討基因多態性與GD的關系和深入認識其發病機制將有重要意義。本研究結果表明，IL-17可能與漢族、維族GD發病有關，IL-17rs763780基因多態性可能與GD發病具有相關性，尤其是TC和TT基因型可能是促使GD發病的危險基因類型。此多態位點在2個民族間的等位基因頻率及基因型分布尚未發現明顯差異，可能與樣本量小、民族分布的地域性有關。新疆是一個多民族聚居的區域，幅員遼闊，民族分布也存在南北疆差異，新疆醫科大學第一附屬醫院是疆內一流的綜合性三甲醫院之一，病員覆蓋全疆，但對本研究來說，受試對象中北疆患者偏多。國內目前已有多個關于漢族GD與IL-17單核苷酸多態性的相關研究，但缺乏有關少數民族的研究，關于IL-17單核苷酸多態性與維吾爾族GD患者的確切關系尚需多中心、大樣本、多位點研究。

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(本文編輯楊晨晨)