維吾爾族、漢族膽固醇結石與ApoB基因多態性的研究

維吾爾族、漢族膽固醇結石與ApoB基因多態性的研究

陳敏1,2， 張濤3， 克力木·阿不都熱依木4， 張成4， 阿麗葉古麗·艾皮熱4

(1,2新疆醫科大學, 烏魯木齊830011, 新疆維吾爾自治區人民醫院2肛腸外科，3重癥醫學一科，4微創疝腹壁外科， 烏魯木齊830001)

摘要：目的探討膽固醇結石與ApoB基因多態性之間的關系，以及是否存在維吾爾族(維族)與漢族間的差異。方法采用前瞻性病例-對照研究方法，選擇2010年3月-2013年8月在新疆維吾爾自治區人民醫院接受手術治療并經手術證實為膽固醇結石患者189例(膽結石組)，其中維族99例，漢族90例。對照組為年齡和性別與膽結石組相匹配的同期在我院體檢中心接受健康體檢者，其中維族93例，漢族97例。采用SNaPshot SNP分型技術進行ApoB基因分型，分析兩組ApoB基因rs520354、rs1367117位點基因型及等位基因分布頻率及其維、漢族間的差異。結果(1)膽結石組中，漢族ApoB基因rs520354位點少見基因型AA頻率明顯高于維吾爾族，差異有統計學意義(χ2=11.028，P<0.05);而對照組中GG、GA、AA基因型頻率未見維、漢族間差異(χ2=1.799，P>0.05)；兩組rs520354等位基因分布頻率均未見維、漢族間差異。兩組rs1367117位點基因型和等位基因分布頻率均未見維、漢族間差異(P>0.05)。(2)漢族膽結石組ApoB基因rs520354少見基因型AA頻率明顯高于對照組，差異有統計學意義(χ2=6.460，P<0.05);而維吾爾族中，rs520354基因型頻率未見兩組間差異(P>0.05)；維、漢族rs520354等位基因分布頻率均未見兩組間的差異；維族和漢族rs1367117位點基因型和等位基因分布頻率均未見兩組間差異(P>0.05)。結論膽結石患者ApoB基因rs520354多態性存在維漢民族間差異，ApoB基因rs520354多態性可能和漢族膽固醇結石相關。ApoB基因rs1367117多態性可能和膽固醇結石無關，且未見維漢民族間差異。但需要進一步增加樣本含量及多中心研究來進一步證實。

關鍵詞：ApoB； 膽固醇結石； 基因多態性

中圖分類號：R656文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.04.010

[收稿日期：2014-09-15]

基金項目：新疆維吾爾自治區自然科學基金(2012211A038)

作者簡介：張紅(1973-)，女，碩士，副主任藥師，研究方向：臨床藥學。

基金項目：新疆維吾爾自治區高?？蒲杏媱濏椖?XJEDU2011I37)

作者簡介：黃玫(1979-)，女，碩士，主治醫師，研究方向：甲狀腺疾病。

ApoB gene polymorphisms in cholesterol gallstone disease in Uygur and Han patients

CHEN Min1,2， ZHANG Tao3, Kelimu Abudureyimu4， ZHANG Cheng4, Aliyeguli Apire4

(1XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China；2DepartmentofAnorectalSurgery,

3DepartmentofFirstIntensiveCareUnit,4DepartmentofMinimallyInvasive,Herniaand

AbdominalSurgery,XinjiangUygurAutonomousRegionPeople′sHospital,Urumqi830001,China)

Abjective: ObjectiveTo explore ApoB gene polymorphisms in cholesterol gallstone disease in Uygur and Han patients. Methods: A prospective case-control study was conducted on Cholesterol gallstone group (189 patients with cholesterol gallstone operation, including 99 Uygur and 90 Han) and control group (190 cases, including 93 Uygur and 97 Han, in good condition, age-and-sex-matched volunteers with physical examination in Medical Centre) in 2012.3-2013.8 from People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region. SNaPshot SNP was adopted to analyze if the distribution of ApoB rs520354 and rs1367117 gene types in the samples of both gallstone group and control group was different between Uygur and Han. Results(1) In gallstone group the infrequent genotype AA frequencies of ApoB gene rs520354 was significantly higher in Hans than that in Uygurs (χ2=11.028， P<0.05), while there was no difference between the two races in controls group (χ2=1.799， P>0.05). ApoBrs520354 gene allele frequencies was not found significantly different between Uygurs and Hans in gallstone group and control group. No significant difference of ApoBgene rs1367117 genotype and allele frequencies was found between Uygurs and Hans in gallstone group or control group. (2) In Hans the infrequent genotype AA frequencies of ApoB gene rs520354 was significantly higher in gallstone group than that in control group (χ2=6.460, P<0.05), while there was no difference between the two races in Uygur (P>0.05). No significant difference of ApoB gene rs1367117 genotype and allele frequencies was found between gallstone group and control in Uygurs or Hans. ConclusionsIt was found out that ApoBrs520354 gene polymorphism was different in Uygur and Han patients with gallstone disease, which indicated some association with gallstone disease Han patients. This study implied that there might be no association of ApoBrs1367117 gene polymorphism with gallstone disease and there was no difference in the race of Uygur and Han. More samples and multi-centered-studies are needed to confirm the findings.

Key words: ApoB; Cholesterol gallstones; gene polymorphism

雖然目前膽結石的確切病因尚不明確，但已經證實膽結石是包括基因和環境等多因素所導致的疾病[1-2]，基因因素在膽石形成中起到了重要作用[3-6]。然而，導致膽結石的常見的致石基因卻并未明確。據最近的一項Meta分析表明，目前研究熱點集中在 XbaI、EcorI、ID位點的多態性[7]。但這幾個位點并非ApoB基因的標簽SNPs(Tagging SNPs)，故其研究結果的代表性較為局限。為了獲取更具有代表性的位點，本研究通過NCBI最新的數據庫，結合標簽SNP及相關文獻[8]，確定了與膽結石關系密切的標簽SNPs:rs520354、rs1367117作為研究對象。采取前瞻性病例-對照研究方法，分析ApoB基因多態性是否存在維吾爾族(維族)與漢族間差異，進而探討ApoB基因多態性與膽結石的相關性。

1資料與方法

1.1臨床資料選擇2010年3月-2013年8月在新疆維吾爾自治區人民醫院住院并經手術證實為膽囊膽固醇結石的患者189例為膽結石組，其中維族99例，平均年齡(51.55±8.92)歲，漢族90例,平均年齡(52.14±11.08)歲；選擇年齡和性別與膽結石組相匹配的同期在我院體檢中心接受健康體檢者190例為對照組，其中維族93例，平均年齡(50.16±9.32)歲，漢族97例,平均年齡(51.73±8.55)歲。所有入選對象均為在新疆生活超過20 a的維吾爾族及漢族人群。兩組人口學資料(年齡、性別、BMI、血脂水平)見表1。

表1　兩組研究對象的一般資料( ±s)

1.2主要試劑與儀器瓊脂糖(上海生工生物工程技術服務有限公司，AB0013-250g)，Marker DL2000(Takara，3427A)，6×Loading buffer (Takara，9156)，基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司，DP319-02)。凝膠成像系統(美國BIORAD GelDoc XR)，水平電泳儀及電源(北京六一儀器廠DYCP-31DN及DYY-6C型)，臺式高速冷凍離心機(上海力新公司，Neofuge 15R)，核酸蛋白定量儀(K5500，北京凱奧科技發展有限公司)。

1.3方法

1.3.1血液樣本采集膽結石組患者及對照組空腹12 h以上，采血時分別用EDTA 抗凝真空采血管和普通生化采血管，采集外周靜脈血各5 mL，抗凝血凍存于-80℃保存，待提取DNA備用。非抗凝血用于生化檢測。

1.3.2血液生化指標的檢測所有血脂指標由新疆維吾爾自治區人民醫院醫學檢驗中心統一測定。采用甘油磷酸氧化酶法測定甘油三酯(TG)，采用氧化酶法測定膽固醇(TC)，采用清除法測定高密度脂蛋白(HDL)，采用選擇性溶解法測定低密度脂蛋白(LDL)。

1.3.3基因組DNA提取采用基因組提取試劑盒提取兩組血中的DNA。

1.3.4SNP標簽的選擇及引物的設計通過NCBI最新的數據庫，登陸人類HapMap計劃數據庫，參照Ⅱ期及Ⅲ期數據庫，利用Haploview4.2軟件查找標簽SNP，獲得ApoB基因的脂代謝紊亂人群中分布的標簽SNP(Tagging SNP)：rs520354、rs1367117，并設計PCR引物，用于擴增目的片段,設計SNP位點的延伸引物(表2)用于單堿基延伸。引物用在線Primer3 軟件設(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)。

表2　ApoB基因rs520354、rs1367117引物序列

1.3.5基因型分析PCR產物用Qiagen公司的HotStarTaq進行多重PCR獲得，其體系為10×Buffer (15 mM Mg2+) 2.0 μL，多重PCR引物(1 μM) 2.0 μL，dNTP(10 mM) 0.6 μL，HotStar (5 U/μL) 0.2 μL，DNA 1.0 μL，Mg2+(25 mM) 1.2 μL，加水不足體系至20 μL。程序為：95℃ 2 min;(94℃ 20 s, 65℃ 40 s) 每個循環下降0.5℃ ,72℃1.5 min,11個循環;94℃ 20 s,59℃ 30 s,72℃1.5 min, 24個循環;72℃ 2 min ，4℃持續。在15 μL PCR產物中加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease I酶，37℃溫浴1 h, 75℃滅活15 min。純化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit進行延伸反應。延伸產物用蝦堿酶(SAP)純化后在ABI3730xl上樣。SNP分型用GeneMapper4.1(Appliedbiosystems)來分析。

1.4統計學處理采用SPSS17.0統計軟件進行統計學分析。兩組等位基因頻率及基因型頻率的差異用χ2檢驗。兩組年齡、BMI、TG、TC、HDL、LDL指標對比采用t檢驗，性別分布對比采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1維吾爾族、漢族ApoB基因rs520354位點基因型及等位基因頻率的分布膽結石組中，漢族ApoB基因rs520354位點少見基因型AA頻率明顯高于維吾爾族，差異有統計學意義(χ2=11.028，P<0.05);而在對照組中，GG、GA、AA 3種基因型分布頻率未見維、漢族差異(χ2=1.799，P>0.05)；兩組等位基因型頻率均無維、漢族差異(χ2=0.227，P>0.05；χ2=0.014，P>0.05)，見表3。

表3　維吾爾族、漢族ApoB基因rs520354位點基因型及等位基因的分布/例

2.2維吾爾族、漢族ApoB基因rs1367117位點基因型及等位基因頻率的分布膽結石組中GG、GA、AA基因型分布頻率在維吾爾族和漢族間未見明顯差異(χ2=2.234，P>0.05);在對照組中，GG、GA、AA基因型分布頻率亦未見維、漢族差異(χ2=3.902，P>0.05)；且兩組等位基因頻率均無維、漢族差異(χ2=0.001，P>0.05；χ2=0.444，P>0.05)，見表4。

2.3膽石組和對照組ApoB基因rs520354位點基因型及等位基因頻率的分布在維吾爾族中，膽結石組和對照組GG、GA、AA基因型分布頻率無差異(χ2=5.386，P>0.05)，兩組等位基因頻率也無差異(χ2=0.459，P>0.05)；漢族膽結石組ApoB基因rs520354少見基因型AA頻率明顯高于對照組，差異有統計學意義(χ2=6.460，P<0.05)，見表5。

2.4膽石組和對照組ApoB基因rs1367117位點基因型及等位基因頻率的分布在維吾爾族中，膽結石組和對照組GG、GA、AA基因型分布頻率無明顯差異(χ2=1.276，P>0.05)，兩組等位基因頻率也無差異(χ2=0.940，P>0.05);在漢族中，膽結石組和對照組GG、GA、AA基因型分布頻率亦未見差異(χ2=0.107，P>0.05)，且兩組等位基因頻率也無差異(χ2=0.112，P>0.05)，見表6。

表4　維吾爾族、漢族ApoB基因rs1367117位點基因型及等位基因的分布/例

表5　膽結石組和對照組ApoB基因rs520354位點基因型及等位基因頻率的分布/例

表6　膽結石組和對照組ApoB基因rs1367117位點基因型及等位基因頻率的分布/例

3討論

膽結石作為多因素導致的疾病，其發病主要受基因和環境等因素的影響[9-11]。研究顯示膽結石的發病在不同種族間存在統計學差異[12-15]。新疆是多民族聚居的區域，膽結石高發，據流行病學調查顯示，新疆膽結石患病率為11.1%～15.5%，明顯高于全國水平[16-17]，且維吾爾族膽結石的患病率明顯高于漢族[18-20]。本研究以在新疆生活超過20 a的維、漢族膽結石患者作為研究對象，借此減小生存環境的影響，進而分析基因因素在維、漢族膽結石發病中的作用，以期發現導致維吾爾族患病率高的基因風險因素。

根據化學成分的分類，膽結石可以分為膽固醇性膽結石、膽色素性膽結石、混合性膽結石三大類[21]。其中膽固醇性膽結石大多發生在膽囊內，由于其發生與代謝密切相關，故亦稱之為“代謝性結石”。為了便于進一步研究基因多態性與血脂代謝及膽結石的相關性，本研究選擇了與代謝最為相關的膽固醇結石患者作為研究對象。ApoB基因的標簽SNPs中，目前的研究熱點為rs520354，因此本研究選取該位點進行研究，便于和既往文獻進行參照。同時選取非熱點標簽SNPs rs1367117進行研究，力求使研究結果更加全面且具有代表性。

3.1ApoB基因型與血脂本研究顯示維吾爾族膽結石組的HDL明顯增高。結合ApoB基因rs520354位點基因型分析，維吾爾族膽結石組AA型的分布頻率明顯低于漢族。究其原因，可能為維吾爾族膽結石組中風險基因型AA分布頻率降低，進而導致HDL增高，使得膽固醇結石的患病風險低于漢族。與Andreotti等[8]針對漢族人群的研究結果一致，即ApoBrs520354位點A等位基因攜帶者的膽結石患病風險是不攜帶者的2倍，可見攜帶A等位基因將增加膽結石的患病風險。漢族膽結石組患者的TC、TG明顯高于對照組，而維吾爾族膽結石組與對照組患者TC、TG無明顯差異。結合基因型分析結果，漢族膽結石組的AA型明顯高于對照組，推測AA型分布頻率增高可能導致TG、TC增高，進而導致漢族膽結石的形成。

3.2ApoB基因型與膽結石ApoB是脂代謝中的主要蛋白質，對低密度脂蛋白(LDL)在血漿中的內穩態起著重要作用。ApoB基因多態性與脂代謝紊亂的發病密切相關[22]。近年來，有關研究表明，ApoB基因多態性與膽石疾病相關[23-24]。ApoB-Xba I多態性被發現與血脂增高相關，且ApoB基因多態性可能為膽結石的易患因素[25]。Stender等[26]研究表明：ApoBrs693CT+TT型比CC型OR值為1.25(0.95～1.63)，提示CC型可能為膽結石的風險基因型。Andreotti等[8]研究也證實：ApoBrs520354多態性與膽管癌及膽結石的發病相關。因此，本研究也選取了ApoB基因rs520354位點作為研究位點，進一步了解其與膽結石的相關性及在不同民族人群中的差異性。本研究選取同在新疆生活超過20 a的維、漢族患者作為研究對象，結果表明：膽結石組中ApoB基因rs520354位點GG、GA、AA基因型分布在維吾爾族和漢族間存在差異且具有統計學意義，而在對照組中，GG、GA、AA基因型未見維、漢族差異，且等位基因頻率在膽囊結石組和對照組間也均不存在維、漢族差異。相關研究結果顯示：攜帶ApoB基因rs520354位點AA純合子者的膽結石患病風險是不攜帶者的1.6倍[8]。本病例-對照研究發現維吾爾族膽結石組和對照組GG、GA、AA基因型分布無差異，兩組等位基因頻率也無差異。但漢族膽結石組和對照組的GG、GA、AA差異有統計學意義，在漢族膽結石患者中少見基因型AA的分布頻率明顯高于對照組，提示AA型基因可能為漢族膽結石的風險基因型，與上述相關研究結果相一致。本研究還發現，同為ApoB基因的標簽SNPs，rs1367117位點并未表現出與膽結石的相關性，也未表現出維、漢族間的差異。可見研究位點不同，基因多態性與疾病相關性的研究結果也不盡相同。因此，在今后的研究中，將進一步就ApoB基因的所有SNPs進行綜合分析并構建相應的單倍體，方可更加全面地了解ApoB基因與膽固醇結石的相關性。本研究亦證明了ApoB基因多態性存在種族差異，且可能為介導膽結石發病的相關因素，但還需進一步大樣本研究來證實。

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(本文編輯楊晨晨)

通信作者：樊勇，女，主任醫師,副教授,碩士生導師，研究方向：甲狀腺疾病，E-mail:nfmfy@163.com。