維藥異常黑膽質成熟劑總黃酮殺傷K562/ADR細胞株作用研究

維藥異常黑膽質成熟劑總黃酮殺傷K562/ADR細胞株作用研究

劉玉， 婁珊， 嚴媚， 王學梅

(新疆醫科大學第一附屬醫院兒科， 烏魯木齊830054)

摘要：目的探討維藥異常黑膽質成熟劑總黃酮(ASMq)對人慢性骨髓性白血病細胞(K562)及人白血病阿霉素耐藥株(K562/ADR)的細胞毒性作用。方法對K562細胞株及K562/ADR細胞株細胞進行培養，在培養過程中注意K562/ADR細胞株對阿霉素的耐藥性。取對數生長期K562、K562/ADR細胞株，96板孔中加入RPMI-1640培養液配制5×104個/mL細胞懸液100 μL/每孔，37℃、5% CO2培養24 h貼壁，然后加入不同濃度(0、50、100、200、400、800和1600 μg/mL)的ASMq，在37℃共培養48 h，每組5個重復，按照CCK-8說明書檢測細胞活性。結果K562細胞株對不同濃度的ASMq的細胞毒性的敏感性不同，差異有統計學意義(P<0.05)；K562/ADR細胞株對0～1 600 μg/mL濃度的ASMq的細胞毒性的敏感性差異無統計學意義(P>0.05)；結論ASMq對K562細胞具有細胞毒性作用，為臨床治療血液腫瘤提供了新的線索。

關鍵詞：異常黑膽質成熟劑總黃酮； K562； K562/ADR； 殺傷； 耐藥逆轉

中圖分類號：R29文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.04.008

[收稿日期：2014-10-25]

Preliminary study on destruction K562/ADR cell effects of

Abnormal Savda Munziq total flavonoids

LIU Yu, LOU Shan, YAN Mei, WANG Xuemei

(DepartmentofPediatry,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830054,China)

Abstract:ObjectiveTo analyse cytotoxicity function of the abnormal savda munziq total flavonoids (ASMq) on K562 and K562/ADR of human being. MethodsK562 and K562/ADR cells were developed to pay attention to adriamycin resistance of K562/ADR. The logarithmic phase K562 and K562/ADR cells 96-well plates with RPMI-1640 culture make up 5×104/mL cells suspension 100 μL/per hole, 37℃ and 5% CO2 24 h post wall were pouring into different concentrations (0, 50, 100, 200, 400,800 and 1 600 μg/mL) of 37℃ ASMq trained 48 h to detect cell activity by the instruction (CCK-8). ResultThere is a statistically significant difference (P<0.05) of K562 with different concentration of ASMq cytotoxic sensitivity. The cytotoxicity of different concentration ASMq to K562/ADR has no statistical significance (P>0.05). ConclusionASMq has cytotoxic effect on the K562 cells, Blood tumor chemotherapy to reduce drug resistance for clinical treatment provides a new clue.

Key words： ASMq； K562； K562/ADR； Cytotoxic

近10多年來腫瘤的臨床化學藥物治療進展較快，尤其是按照細胞動力學的特點設計鋪排的聯合序貫化療、新藥的泛起、用藥方法的改進使化療療效明顯提高。當今抗腫瘤藥物發展的重點之一是從天然藥物中尋找活性成分，而我國有豐富的中藥材資源以及數千年的中醫中藥理論與實踐經驗，對中藥抗腫瘤作用的研究與開發前景良好。目前已篩選出一些并廣泛應用于臨床顯示出良好的效果。維吾爾醫學認為腫瘤患者表現為異常黑膽質性[1]，異常黑膽質成熟劑總黃酮(ASMq)對人肝癌細胞(HepG2)[2]、人宮頸癌細胞(Hela)、T 淋巴瘤細胞[3]、乳腺癌細胞[4]體外具有抗癌作用，但ASMq對急性白血病多藥耐藥細胞株的逆轉研究尚屬空白。本研究旨在了解ASMq對人慢性骨髓性白血病細胞(K562)及人白血病阿霉素耐藥株(K562/ADR)是否存在細胞毒性作用。

1材料與方法

1.1儀器與試劑K562、K562/ADR細胞株由中國醫學科學院天津血液病研究所提供。K562/ADR為阿霉素(ADR)長期誘導 K562敏感株而建立的耐藥細胞株，阿霉素 (Adramycin, Adr)為深圳萬樂藥業有限公司產品。異常黑膽質成熟劑總黃酮(ASMq)由新疆奇康哈博維藥有限公司提供。青霉素-鏈霉素雙抗(10 000 U)為美國Hyclone公司產品。主要儀器：CO2細胞培養箱(上海力康儀器有限公司Smart Cell HF-90)，生物安全柜(上海力康儀器有限公司Neofuge 15R)，臺式低速離心機(上海飛鴿儀器有限公司 TGL-16GB0)，流式細胞儀，液氮罐(日本尼康公司Eclise TS100-F)。

1.2方法

1.2.1試劑配制20%血清完全培養基：20 mL的胎牛血清加入90 mL的DMEM培養基中，添加1 mL的青-鏈霉素雙抗溶液。無血清培養基：10 mL的DMEM高糖培養基，添加100 μL的青鏈-霉素雙抗溶液(10 000 U)。20%DMSO細胞凍存液：2 mL的DMSO溶液加入8 mL的完全培養基中。阿霉素配制：將ADR用PBS配成2 mg/mL的溶液，0.22 μm濾膜過濾，PBS稀釋。ASMq溶液配制：用滅菌水溶解ASMq，使其終濃度為12.5 mg/mL,0.22 μm濾膜過濾。

1.2.2細胞培養細胞復蘇：從液氮中取出凍存的細胞，立刻置于37℃水浴中快速晃動凍存管使細胞快速解凍，倒置顯微鏡下觀察細胞密度并接種到培養瓶中，37℃、飽和濕度、5%CO2細胞培養箱中培養。細胞傳代：觀察培養瓶(25 cm2)中細胞貼壁融合達90%時，即可進行細胞的傳代，操作步驟如下：開啟生物安全柜紫外消毒30 min，以75%乙醇擦拭臺面滅菌，并預先準備3個細胞培養瓶(25 cm2)、15 mL離心管、無菌過濾的PBS、0.25%胰酶溶液、完全培養基，取出長滿細胞的培養瓶，倒空瓶中的培養基，加入2 mL過濾滅菌的PBS緩沖液反復沖洗2遍，倒空PBS緩沖液，每瓶中加入1 mL的0.25%的胰酶溶液，使胰酶溶液平鋪在細胞層面上，緩緩搖動細胞培養瓶，待細胞70%脫落時加入1 mL的完全培養基終止胰酶的消化作用，并用吸頭反復沖洗培養瓶底將未脫落的細胞沖洗下來，轉移液體至15 mL的離心管中，1 800 r/min離心5 min，小心吸棄離心管中的液體，并用1 mL的完全培養基重懸沉淀的細胞，倒置顯微鏡下觀察細胞調整合適的細胞密度接種到培養瓶中,37℃、飽和濕度、5%CO2細胞培養箱中培養，6 h后持續觀察細胞貼壁狀態，待細胞達到50%～70%貼壁融合時倒空瓶中培養基，重新加入5 mL的含0.2 mm的完全培養基，繼續培養。細胞凍存：消化、離心、重懸步驟同細胞傳代，取1 mL的細胞重懸液，加入1 mL的20%DMSO的細胞凍存液顛倒混勻，并移至2 mL的凍存管中，凍存管中細胞經4℃(20 min)、-20℃(20 min)的程序降溫后，轉移至液氮中凍存。

1.2.3細胞株培養K562、K562/ADR細胞均用 RPMI1640 培養液(含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL及鏈霉素100 μg/mL)，相對濕度95%、5% CO2培養箱中37℃培養, 2 d傳代1次。K562/ADR細胞開始培養時使用無ADR完全培養基，細胞傳2代后使用加入ADR的完全培養基(加ADR時首次加入750 ng/mL，再次傳代后加入1 000 ng/mL，并確定后續培養的終濃度為1 000 ng/mL)，以維持其耐藥性。

1.2.4ASMq對K562/ADR細胞的細胞毒性作用取對數生長期K562、K562/ADR細胞，96孔板中加入RPMI-1640培養液配制 5×104個/mL細胞懸液100 μL/每孔，37℃、5% CO2培養24 h 貼壁；后加入100 μL不同濃度(0、50、100、200、400、800和1 600( μg/mL)的ASMq 37℃共培養48 h，每組5個重復，按照CCK-8說明書檢測細胞活性。

2結果

K562細胞株對不同濃度ASMq的細胞毒性的敏感性不同，差異有統計學意義；K562/ADR細胞株對不同濃度ASMq的細胞毒性的敏感性差異無統計學意義,結果見表1、圖1～6。

濃度/(μg/mL)K562OD值K562/ADROD值00.264±0.011△○0.652±0.040500.260±0.014△○0.745±0.0651000.263±0.033△○0.683±0.1152000.246±0.020△○0.701±0.1274000.240±0.042△○0.714±0.1388000.078±0.0360.714±0.09416000.014±0.0030.670±0.102

注：與1 600 μg/mL組比較，△P<0.01； 與800 μg/mL組比較，○P<0.01。

3討論

白血病是造血系統的惡性增殖性疾病，是嚴重威脅小兒生命和健康的疾病之一。小兒時期發生的白血病多為急性白血病。兒童白血病具有2個特點：一是惡性程度高，病情發展迅速，大多是急性發病的特點。兒童白血病的治療以化療為主，化療的原則是多藥聯合和多療程治療，白血病細胞產生耐藥性是目前白血病治療失敗的主要原因之一。目前認為耐藥白血病的發生有2種可能：一種可能是原來存在于體內的耐藥細胞亞群,隨著敏感細胞被選擇性殺死而逐漸聚集、增殖，并最終成為主要細胞群，此為原發性耐藥；另一種可能是由于化療藥物誘導使細胞特性發生改變，導致耐藥性的產生，此為繼發性耐藥。目前對中藥抗腫瘤作用的研究與開發前景良好，維吾爾族醫學也在積極尋找能夠抗腫瘤的藥物。異常黑膽質成熟劑(國家發明專利編號：C082130082.8)是維吾爾醫復方制劑，由破布木(Cordia dichotoma Forst.)、紅棗(Ziziphus jujuba Mill.)、甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、牛舌草(Anchusa italica Retz.)、小茴香(Foeniculum vulgare Mill.)、錦草(Euphorbia humifusa Willd.)等藥材組成，用于治療由異常黑膽質所導致的腫瘤、糖尿病和心血管疾病等。其主要成分含糖、皂苷、酚、黃酮、生物堿、香豆素和/或內酯、有機酸和氨基酸等成分，其中異常黑膽質成熟劑總酚提取物對人急性早幼粒細胞白血病細胞株 (HL-60)增殖的抑制作用明顯，對總酚提取物進行進一步分離，其中含總黃酮量最高的組分對HL-60細胞的抑制作用最強。

圖1K562 96孔板加ASMq 400 μg/mL后48 h觀察(×400)

圖2K562/ADR 96孔板加ASMq 400 μg/mL后觀察(×400)

圖3K562 96孔板加ASMq 800 μg/mL后48 h觀察(×400)

圖4K562/ADR停藥96孔板加ASMq后 800μg/mL觀察(×400)

圖5K562 96孔板加ASMq 1 600 μg/mL后48 h觀察(×400)

圖6K562/ADR停藥96孔板加ASMq 1 600 μg/mL后觀察(×400)

本研究觀察了ASMq對K562及K562/ADR細胞株的細胞毒性及其與化療藥物的協同作用，結果顯示，K562細胞株對不同濃度ASMq的細胞毒性的敏感性不同，提示ASMq對K562細胞有細胞毒性作用，而在0～1 600 μg/mL的濃度范圍內對K562/ADR沒有細胞毒性作用。腫瘤多藥耐藥是指腫瘤細胞在接受化療過程中，一旦對某種化療藥物產生耐藥性，便同時對其他結構上無關作用機制各異的藥物均產生交叉耐藥的廣譜耐藥現象[5]，根據試驗結果提示K562/ADR對ASMq在0～1 600 μg/mL濃度范圍內耐藥。增加ASMq是否對K562/ADR細胞株有細胞毒性作用有待進一步研究。ASMq對K562細胞株的細胞毒性作用機制可能是異常黑膽質成熟劑中含有的總黃酮成分能調控凋亡基因的表達,能明顯抑制腫瘤細胞生長,誘導腫瘤細胞凋亡[6-8]。近10多年來腫瘤的臨床化學藥物治療進展較快，是綜合治療腫瘤的重要措施，但是目前化學藥物還缺乏選擇性作用。化學藥物既能殺傷癌細胞，但因為其毒性較大，也會給機體帶來損傷。中醫中藥能扶正培本，法邪解毒，提高免疫功能，既能減輕化療的毒副作用，保護和防止機體正常組織細胞和臟器遭受化療的傷害，又能增強機體免疫系統識別癌細胞，對化療起增效作用，提高療效。因此，中醫藥與化療的結合，是進一步提高腫瘤治愈率的重要途徑。動物實驗研究表明，ASMq能夠促進免疫細胞的生長和增殖，提高機體的免疫功能,增強免疫器官中抗氧化酶的活性,增強機體的抗癌能力[8-9]。

已有較多研究表明ASMq對宮頸癌細胞(Hela)、肝癌細胞(HepG2)、T 淋巴瘤細胞等多種癌變細胞的體外生長具有較明顯的抑制作用。本研究表明ASMq對K562有細胞毒性作用，ASMq有可能成為臨床治療急性白血病的聯合用藥之一。但是在小劑量范圍內對耐藥細胞無細胞毒性作用，增加ASMq的劑量對耐藥株是否有細胞毒性作用或耐藥逆轉作用尚有待進一步研究。

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(本文編輯周芳)