腎透明細胞癌患者血漿中miRNA-378的表達及其臨床意義

腎透明細胞癌患者血漿中miRNA-378的表達及其臨床意義

畢興, 牛越, 胡拉西·達吾提, 甫爾海提·沙依提, 袁帥, 楊峰, 田孟真, 陳鵬

(新疆醫科大學附屬腫瘤醫院泌尿科, 烏魯木齊830011)

摘要：目的探討腎透明細胞癌患者和健康人群血循環中微小RNA-378(microRNA-378，即miRNA-378)的表達差異及其臨床意義。方法收集腎透明細胞癌患者(腎透明細胞癌組)和健康人群(對照組)血液標本各20例，采用實時定量PCR的方法檢測兩組標本miRNA-378的表達情況，比較兩者的表達差異,并分析miRNA-378的表達與性別、年齡、民族、腫瘤大小、腫瘤分期、病理分級的相關性。結果與對照組比較，腎透明細胞癌組血漿中miRNA-378呈現高表達,其表達為(2.13±1.8)，平均表達量較對照組升高5倍；miRNA-378的表達水平與患者性別、年齡、民族、腫瘤大小、腫瘤分期、病理級別沒有明顯相關性。結論腎透明細胞癌患者血漿中miRNA-378呈現高表達，有可能成為篩查腎透明細胞癌患者的生物學指標。

關鍵詞：微小RNA; 腎細胞癌； 實時定量PCR

中圖分類號：R737.11文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.05.022

[收稿日期：2014-12-02]

The expression and clinical significances of miRNA-378 in serum of

patients with renal clear cell carcinoma

BI Xing, NIU Yue, Hulaxi Dawuti, Fuerhaiti Shayiti, YUAN Shuai, YANG Feng,

TIAN Mengzhen, CHEN Peng

(DepartmentofUrology,AffilliatedTumorHospital,XinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression difference and clinical significance of miRNA-378 in serum between renal clear cell carcinoma patients and healthy people. Methods20 blood samples were extracted from RCC patients (RCC group) and healthy people (the control group). We identified the miRNA-378 expression levels by RT-PCR method, compared the expression differences, and analyzed the expression of miRNA-378 to see if there are correlations with gender, age, nationality, tumor size, tumor stage, and pathological grading. ResultsCompared with the control group, the miRNA-378 expression levels in RCC group blood serum were higher, it is (2.13±1.8), and the average expression quantity was 5 times higher than that in the control group； there is no obvious correlation between miRNA-378 expression level and gender, age, nationality, tumor size, tumor stage and pathological grading. ConclusionThe miRNA-378 presented high expression in RCC patients, so it was expected to be the biomarker of RCC.

Key words: microRNA; renal cell carcinoma; real time PCR

腎透明細胞癌(ccRCC)約占成人惡性腫瘤的2%，居泌尿系統惡性腫瘤的第2位[1]。早期ccRCC外科手術治療的5年生存率可達90%，而中晚期ccRCC的5年生存率不足50%[2]。但是目前尚沒有一種生物學指標能夠早期診斷ccRCC或者提示復發。近年的研究發現微小RNA(microRNA，miRNA)與腫瘤的發病關系密切，有可能成為一種早期診斷和治療腫瘤的新途徑[3]。有研究提示miRNA-378在肝癌、結腸癌的組織中呈現低表達[4-5]，可能在這些腫瘤中起到抑癌基因的作用。目前對miRNA-378在腫瘤患者血循環中表達情況的研究相對較少。本研究用RT-PCR方法檢測腎透明細胞癌患者和健康人群血循環中miRNA-378表達情況，對比分析兩者的差異，以探討血循環中miRNA-378的表達對診斷腎透明細胞癌的意義。

1材料與方法

1.1臨床資料收集新疆醫科大學附屬腫瘤醫院2013年4月-2014年7月腎透明細胞癌患者術前外周血液標本(腎透明細胞癌組)和門診體檢志愿者外周血液標本(對照組)各20份。腎透明細胞癌組病例均經病理證實為腎透明細胞癌，排除其他腎臟相關良性病變(如腎炎、腎病綜合征、糖尿病腎病、狼瘡腎)，并且未行任何腫瘤相關治療。其中男性15例，女性5例；年齡(56.09±11.16)歲；病理分期：Ⅰ～Ⅱ期13例，Ⅲ～Ⅳ期7例；Furman分級：G1～2級13例，G3～4級7例。對照組病例排除患有其他腎臟相關疾病(如腎炎、腎病綜合征、糖尿病腎病、狼瘡腎)，其中男性15例，女性5例；年齡(53.24±11.22)歲。

1.2主要設備和試劑熒光定量PCR儀(美國ABI公司,型號7500),高速離心機(SIGMA公司),PrimeScriptTM RT reagent Kit(ABI公司),Takara逆轉錄試劑盒(大連寶生公司,型號rr037A),MiRcute miRNA Isolation Kit(天根公司)。

1.3方法

1.3.1外周血采集腎透明細胞癌組患者和對照組體檢者均于早晨空腹無菌條件下用EDTA管抽取外周全血5 mL，常溫下以3 000 r/min離心6 min，吸取上清液2 mL，用無酶EP管裝取并保存在-80℃冰箱中。血液標本在室溫下放置時間<1 h。

1.3.2提取總RNA及質量檢測采用miRcute miRNA提取分離試劑盒(miRcute miRNA Isolation Kit)提取總RNA，按照其說明步驟進行：裂解、離心、miRspin吸附、再離心、miRelute吸附、再次離心、去蛋白、漂洗、最后離心1次即獲得總RNA。得到的總RNA經過純度和濃度測定后直接進行逆轉錄反應，提取過程中應用RNA酶抑制劑以防止其降解。

1.3.3逆轉錄反應采用Takara rr037A逆轉錄試劑盒對總RNA進行反轉錄。按照說明書配制10 μL體系：5×PrimeScript?Buffer(for Real Time) 2 μL，PrimeScript?RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Gene specific primer(5 μM) 0.5 μL，Total RNA+Free ddH2O 7 μL。反轉錄合成cDNA第1鏈。經過42℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ ∞即可得到cDNA模板。

1.3.4實時熒光定量PCR采用PrimeScriptTM RT reagent Kit，以cDNA為模板，用miRNA特異引物進行PCR反應，miRNA-378和U6的上游和下游引物由北京奧科鼎盛公司合成。其具體結構如下：miRNA-378a 上游引物: 5′-TGTCTGAACTGGACTTGGAGTCA-3′, miRNA-378a 下游引物:5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3′,U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。按照說明書配制20 μL體系：包括2× Master Mixture 10 μL、PCR Forward Primer(10 μM/μL) 1 μL、PCR Reverse Primer(10 μM/μL) 1 μL、cDNA模板(稀釋5倍) 2 μL、ddH2O 6 μL。經過50℃ 2 min，95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個循環。每個樣本均重復3次，取平均值。Ct值為待檢基因實時熒光強度明顯大于背景循環數，△Ct= Ct(miRNA-378)-Ct(U6)。外周血中miRNA-378的相對表達量用2-△Ct法計算。

1.4統計學處理采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析。采用兩獨立樣本t檢驗分析兩組血漿中miRNA-378表達的差異。miRNA-378表達水平與臨床病理特征的相關性運用 Pearson法進行相關性分析。運用ROC曲線下面積分析miRNA-378的意義,檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1兩組外周血中miRNA-378的表達腎透明細胞癌組血漿miRNA-378表達量為(2.13±1.87),對照組表達量為(0.41±0.54)，差異有統計學意義(P<0.01)，腎透明細胞癌組中miRNA-378表達量較對照組平均高5倍。以miRNA-378作為生物學指標鑒別腎透明細胞癌患者和健康人群的曲線下面積(AUC)為0.825，見圖1。以0.039為相對表達量(2-△Ct)節點，特異度和靈敏度均為80%。

圖1　miRNA-378診斷腎透明細胞癌的曲線下面積

2.2腎透明細癌組血漿miRNA-378表達水平與臨床病理特征的相關性血漿中miRNA-378的表達水平與患者性別、年齡、民族、腫瘤大小、腫瘤的病理分期及病理核分級無明顯關系(P>0.05)，見表1。

臨床病理因素例數miRNA-378t值P值性別 男151.89±1.900.250.17 女52.94±1.66年齡/歲 ≥50152.65±1.93-0.3560.055 <5050.99±1.16民族 漢族162.02±1.820.050.784 維族42.48±2.21腫瘤直徑/cm ≥751.11±2.04-0.3350.066 <7152.42±1.77病理分期 早期(Ⅰ-Ⅱ)132.43±1.57-0.2860.116 中晚期(Ⅲ-Ⅳ)71.59±2.31核分級(Furman分級) 高分化(G1-G2)131.91±1.740.0870.633 中低分化(G3-G4)72.51±2.13

3討論

miRNA平均由18～26個核苷酸(nt) 組成一個小分子單鏈RNA，通過與靶mRNA配對結合對基因表達進行調控。研究發現miRNA除了參與機體細胞的增殖、分化等多種生物學進程外，還在腫瘤細胞發育、凋亡、侵襲等過程中發揮作用[6]。不同的腫瘤細胞中有不同的miRNA上調或下調，而相同腫瘤細胞中miRNA的表達相對特異穩定[7]。因此，通過分析腫瘤相關miRNA的表達情況，可能找到腫瘤診斷、分析預后、用藥療效判斷的新方法。

針對腎透明細胞癌(ccRCC)組織的miRNA表達的相關的研究表明miRNA有可能成為ccRCC早期診斷和治療的新方向。Huang等[8]通過基因芯片及Northern blotting技術研究了11例腎透明細胞癌及周圍正常腎組織的miRNA變化，發現有48種只在腎癌組織中特異性表達。

然而組織標本的獲得可能給患者造成創傷，并有腫瘤種植轉移風險。相比而言，外周血中的miRNA更容易獲取并能隨時監測，因此臨床應用更加簡便，利于推廣。近年研究顯示，血漿miRNA可能成為前列腺癌(miRNA-26a)[9]、結腸癌(miRNA-29和miRNA-92a)[10]、乳腺癌(miRNA-195)[11]等多種腫瘤診斷與治療的生物標志物。miRNA-378在多種腫瘤的衍生過程中發揮作用也逐步受到關注。Deng等[12]就發現miRNA-378在胃癌組織中起到抑癌作用。

本研究應用實時定量PCR法檢測miRNA-378在腎透明細胞癌患者和健康人群血漿中的表達情況，結果顯示腎透明細胞癌患者血漿中miRNA-378的表達明顯升高，比健康人群平均高5倍(P<0.01)。提示miRNA-378在腎透明細胞癌的發生、發展過程中可能具有特殊作用。本研究進一步分析驗證顯示，應用血漿miRNA -378診斷腎透明細胞癌的AUC為0.825。以0.039為相對表達量(2-△C)的節點，特異度和靈敏度均可達到80%。因此，初步確定miRNA-378可以作為診斷腎透明細胞癌的生物學指標。不過目前尚不清楚ccRCC患者血漿中miRNA-378的高表達與癌組織中miRNA-378表達是否具有一致性，也可能兩者表達正好相反，即血漿中顯示為上調,組織中卻為下調，這有待于進一步研究證實。

本研究結果初步顯示：腎透明細胞癌患者外周血中miRNA-378的表達與性別、年齡、民族、腫瘤大小、腫瘤的病理分期及病理核分級沒有相關性(P>0.05)。由此，初步認為miRNA-378尚不能作為預后判斷和治療監測的指標。

本研究尚有諸多不足有待提高。首先因為樣本量少，可能存在偏倚，影響部分結果，部分結論還需大樣本試驗結果證實；其次，ccRCC患者血漿和組織中miRNA-378的表達是否具有一致性有待進一步研究；最后，miRNA-378在腎透明細胞癌患者血漿中高表達的生物學機制還有待更深層探索。

綜上所述，腎透明細胞癌患者外周血中miRNA -378高表達可能與腎透明細胞癌的發生、發展相關，有可能成為腎透明細胞癌患者早期篩查的生物學指標。

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(本文編輯楊晨晨)