維藥苜蓿子中總多酚與總多糖的含量測定

維藥苜蓿子中總多酚與總多糖的含量測定

劉杰1， 張鳳雪2， 阿來·賽坎2， 丁文歡3， 田樹革3

(新疆醫科大學1附屬中醫醫院， 烏魯木齊830002；2中醫學院,3中心實驗室, 烏魯木齊830011)

摘要：目的建立苜蓿子中總多糖與總多酚含量的測定方法。方法以葡萄糖、沒食子酸為對照品，以蒽酮-硫酸、福林試劑-碳酸鈉溶液體系為顯色劑，采用可見分光光度法在檢測波長582、760 nm處測定10批苜蓿子中總多糖與總多酚的含量。結果葡萄糖溶液濃度在0.02~0.12 mg/mL、沒食子酸溶液濃度為1~7 μg/mL (r=0.999 5)范圍內與吸光度呈良好的線性關系，加樣回收率為104.30 %、101.46%，RSD為2.40 %、2.90 %,總多糖的含量為22.34~53.43 mg/g，總多酚的含量為3.03~4.88 mg/g。結論可見分光光度法簡單，準確性、重復性良好，為苜蓿子多糖與多酚的進一步研究奠定了基礎。

關鍵詞：苜蓿子； 總多糖； 總多酚

中圖分類號：R914文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.05.012

[收稿日期：2014-12-01]

基金項目：新疆維吾爾自治區高技術研究發展計劃項目(201317102)

作者簡介：史銀基(1981-)，女，在讀碩士，助理研究員，研究方向：藥物制劑與新劑型的研究。

Determination of total polyphenols and total polysaccharides in Medicago sativa L.

LIU Jie1, ZHANG Fengxue2, Alai Saikan2, DING Wenhuan3, TIAN Shuge3

(1DepartmentofThePharmaceuticalTheTCMHospitalAffiliatedtoXinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830002,China;2CollegeofTCM,3CentralLaboratoryofXinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo develop a method for content determination of total polysaccharides and polyphenols in Medicago sativa L. seeds. MethodsGlucose and Gallic acid was used as a reference substance, by anthrone sulfuric acid and Folin reagent - sodium carbonate solution system as chromogenic agent； the visible spectrophotometry was used to determine the contents of total polysaccharides and polyphenols in 10 batches of Medicago sativa L. seeds by UV at 582 nm and 760 nm. ResultsThe concentration of glucose in 0.02-0.12 mg/mL and gallic acid in the concentration of 1-7 g/mL (r=0.999 5) showed a good linear relationship between absorbance range. The average recovery was 104.30%, 101.46% with RSD=3.40%, 2.90%, the contents of polysaccharides and polyphenols were 22.34-53.43 mg/g and 3.03-4.88 mg/g. ConclusionThe method is simple, sensitive and accurate, which can offer a basic data for the development research of the Medicago sativa L.

Key words：MedicagosativaL.; total polysaccharides; total polyphenols

苜蓿子是豆科植物紫花苜蓿(Medicago sativa L.)的干燥成熟的種子。其為維吾爾醫常用的藥物之一，載于《藥物之園》，維語名叫比地烏拉蓋，有潤便、理血、通經、催乳、強身、生精的功效；常用于大便秘結、貧血、水腫、閉經、乳汁不通、陽痿、體弱病、關節炎、癩皮病等的治療[1]。現代研究證明，植物多糖具有多種藥理活性，如抗炎、抗氧化、抗缺氧、抗衰老、抗腫瘤、抗損傷、抗應激作用以及降血糖等[2]。植物多酚中的多元酚結構多具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤以及抗脈硬化等功效，常用于冠心病與中風等心腦血管疾病的防治[3-4]，多糖的測定以葡萄糖為對照品，采用蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸比色法[5-8]，多酚的測定以沒食子酸為標準品，采用超聲輔助提取，以Folin-Ciocalteu比色法[9]測定苜蓿子多酚的含量。本實驗采用可見分光光度法測定10批苜蓿子中總多糖、總多酚的含量，以期為苜蓿子多糖及多酚的開發利用提供基礎數據。

1儀器與試藥

752S可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)，XS-105型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，TDL-40B型離心機(上海安亭科學儀器廠)，KQ3200DE型數控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。葡萄糖對照品(天津市天新精細化工開發中心，批號：20101024)，沒食子酸對照品(上海源葉生物科技有限公司，含量>98%)，乙醇、三氯甲烷、正丁醇、濃硫酸以及蒽酮等試劑均為分析純。10批苜蓿子樣品采購于各地維吾爾藥店，分別為和田6批、喀什3批、加拿大1批，由新疆醫科大學中醫學院中藥資源教研室教師徐海燕鑒定均為豆科植物紫花苜蓿(Medicago sativa L.)的干燥成熟果實。

2方法與結果

2.1對照品儲備液的制備精密稱取葡糖糖對照品0.200 0 g，置于100 mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，得葡萄糖對照品儲備液。精密稱取沒食子酸標準品10 mg，置于100 mL的容量瓶中，加入蒸餾水溶解并定容至刻度，即得0.1 mg/mL的沒食子酸對照品儲備液。

2.2供試品溶液的制備將苜蓿子粉碎，過60目篩，分別稱取2 g，置于錐形瓶中，加入50 mL蒸餾水超聲提取30 min，過濾，濃縮至30 mL，分別加入30 mL的Sevage試劑(氯仿-正丁3∶1)，振蕩30 min以除蛋白，棄去Sevage試液層，加入150 mL 95%乙醇到濾液層，震蕩、醇沉過夜，離心，棄去上清液，得苜蓿子多糖，將苜蓿子多糖分別用蒸餾水定容至100 mL，再分別取1 mL稀釋至10 mL，即得供試品溶液1。將苜蓿子粉碎，過60目篩，分別稱取1 g, 置于錐形瓶中，第1次25 mL 70%(體積分數)超聲提取30 min，過濾；第2次加20 mL 70%(體積分數)超聲提取30 min，過濾，合并濾液，定容至50 mL，得供試品溶液2。

2.3Folin-Cioealteu試劑的制備分別稱取鉬酸鈉25.0 g、鎢酸鈉100.0 g，置于圓底燒瓶中加入700 mL蒸餾水溶解，加入50 mL 85%的磷酸和和100 mL的濃鹽酸充分混勻，加熱回流12 h，放冷，再加入硫酸鋰150 g、蒸餾水50 mL以及雙氧水0.2 mL，加熱至沸騰，保持15 min至亮黃色，直至不帶微藍和綠色，使雙氧水完全揮發，冷卻，用蒸餾水定容至1 000 mL，過濾，置棕色瓶中避光儲存。

2.4標準曲線的測定分別精密吸取葡萄糖對照品儲備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL置于6個10 mL的容量瓶中，用蒸餾水定容，再分別吸取1 mL稀釋后的對照品溶液置于試管中，各加4 mL硫酸-蒽酮溶液，搖勻，室溫放置13 min，置沸水中水浴加熱10 min后取出，冷卻至室溫。于582 nm處測定其吸光度，以葡萄糖對照品溶液濃度(C)為橫坐標、吸光度A為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為A=6.787 C+0.045(r=0.999 6)，結果表明葡萄糖溶液濃度在0.02~0.12 mg/mL范圍內與吸光度值線性關系良好。

精密吸取多酚對照品儲備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL分別置于6個10 mL的干燥具塞比色管中，加入Folin-Cioealteu試劑1 mL，混勻，再加入20 %的碳酸鈉溶液2 mL，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，在75℃恒溫水浴30 min，于760 nm波長處測定其吸光度值。以沒食子酸對照品溶液濃度(C)為橫坐標、吸光度A為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為A=145.28 C +0.032(r=0.999 5)，結果表明沒食子酸溶液濃度在1～7 μg/mL范圍內與吸光度值線性關系良好。

2.5重復性試驗精密稱取同一批苜蓿子樣品6份，按供試品溶液的制備方法提取苜蓿子多糖，并按“2.4”項下多糖標準曲線以及多酚標準曲線的測定方法操作，在582 nm和760 nm處分別測定其吸光度值，算得其RSD值分別為2.10 %和1.90 %，表明該方法的重復性較好。

2.6穩定性試驗取供試品溶液，分別在0、1、2、4、8 h按測定標準曲線同樣的方法操作，測定其吸收度，根據吸光度值計算RSD=1.81%，表明樣品溶液在8 h內穩定。

取供試品溶液，分別于配制后的0、30、60、120、180、240 min，按測定標準曲線同樣的方法操作，測定其吸收度值，結果表明供試品溶液的吸光度值在30 min內較為穩定，30 min后開始下降，因此供試品溶液在配制完成后應在30 min內測定吸光度。

2.7回收率試驗精密稱取第一批苜蓿子樣品各0.5 g，共6份，分別加入20 mg的葡萄糖對照品，再按供試品溶液的制備方法以及標準曲線的測定方法操作，計算其回收率為104.30%，RSD為2.40%，表明方法的準確性較好。

精密稱取第一批苜蓿子樣品各0.5 g，共6份，各加入沒食子酸對照品4 mg，按供試品溶液的制備方法提取苜蓿子多酚，并按測定多酚標準曲線同樣的方法操作，結果加樣回收率為101.46 %，RSD為2.90 %，表明該方法的準確性較好。

2.8苜蓿子多糖、多酚含量的測定吸取1 mL的供試品溶液1，按“2.4”項下多糖標準曲線的方法測定吸光度。將吸光度值帶入標準曲線方程得到樣品溶液中苜蓿子多糖的濃度，并計算其多糖的含量，結果總多糖的含量為22.34~53.43 mg/g，見表1。

吸取0.4 mL的供試品溶液2，按“2.4”項下多酚標準曲線的方法測定吸光度。將吸光度值帶入標準曲線方程得到樣品溶液中多酚的濃度，并計算其總多酚的含量，結果總多酚的含量為3.03~4.88 mg/g，見表1。

表1　10批苜蓿子中總多糖、總多酚含量結果(n=3)

3討論

本實驗采用水提醇沉法提取苜蓿子多糖，將苜蓿子粉末用水超聲提取，過濾、放冷，得提取液，往提取液中加入乙醇使含醇量達到80 %，苜蓿子多糖在醇溶液中溶解度降低而析出。提取液應適當濃縮，以減少乙醇用量，但應控制濃縮程度。濃縮提取液應冷卻后再加入乙醇，以免乙醇受熱揮發損失。加入乙醇時應慢加快攪，使反應充分。多糖在與硫酸-蒽酮溶液反應顯色時放置時間的長短對其吸光度值影響較大，故在測定過程中應盡量保證每個樣品的反應時間一致，以降低誤差。

植物多酚可溶于水、甲醇、乙醇等極性較強的溶劑，大多選用50%~70%的乙醇提取時，多酚的含量較高，本實驗通過對比水提與70%的乙醇提取所得的多酚含量差異，采用70 %的乙醇提取苜蓿子中的多酚，測定苜蓿子中多酚含量時，其穩定性實驗結果顯示樣品在30 min內含量較穩定，而在60 min時以及之后測定的結果顯示其多酚含量有所降低，可能與酚羥基的性質有關，因為酚羥基易容易氧化，從而影響實驗結果。

本實驗采用超聲提取法進行苜蓿子多糖、多酚的提取，方法簡便易行。采用可見分光光度法測定10個不同批次苜蓿子多糖、多酚含量，結果表明不同批次的苜蓿子多糖、多酚含量有所差異，但10批苜蓿子中多糖的含量均較高，而多酚的含量相對較低。實驗結果為苜蓿子多糖、多酚的進一步開發利用提供了基礎數據。

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(本文編輯施洋)

通信作者：黃華，女，碩士，研究員，碩士生導師，研究方向：中藥藥效篩選及評價，E-mail：huangh6505@163.com。