原代乳鼠心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)的改進(jìn)

原代乳鼠心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)的改進(jìn)

包馨慧, 李曉梅, 楊毅寧, 馬依彤, 陳邦黨, 陶靜, 陳小翠

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟中心, 烏魯木齊830054)

摘要:目的探討提高細(xì)胞純度、存活率及活性的乳鼠心肌分離培養(yǎng)方法。方法改進(jìn)心臟組織的處理方法，用胰酶預(yù)處理后再用II型膠原酶依次處理心肌組織，采用差速貼壁及化學(xué)藥物純化心肌細(xì)胞。結(jié)果提取的單個(gè)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，呈類(lèi)圓形；12 h時(shí)大部分細(xì)胞貼壁；24 h后幾乎全部貼壁，僅見(jiàn)少量漂浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞伸出偽足，呈梭形、三角形等，細(xì)胞出現(xiàn)自主搏動(dòng)。48 h后心肌細(xì)胞偽足間形成聯(lián)接，交織成網(wǎng)狀，局部心肌細(xì)胞出現(xiàn)同步搏動(dòng)。3 d后心肌細(xì)胞聚集成簇，呈島嶼樣搏動(dòng)。心肌細(xì)胞存活率為96.6%，純度>96%。結(jié)論此改進(jìn)方法所提取培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞存活率及純度高，細(xì)胞活性好，結(jié)構(gòu)功能完整，可用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)中原代乳鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞:心肌細(xì)胞； 原代培養(yǎng)； 新生大鼠

中圖分類(lèi)號(hào)：Q463文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.05.010

[收稿日期：2014-07-02]

基金項(xiàng)目：國(guó)家藥典委員會(huì)國(guó)家藥品(維藥)標(biāo)準(zhǔn)提高項(xiàng)目(510)

作者簡(jiǎn)介：劉杰(1980-)，男，碩士，主管中藥師，研究方向：中藥質(zhì)量控制。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81260624)

作者簡(jiǎn)介：木克熱木·吐地買(mǎi)提(1988-)，女(維吾爾族)，在讀碩士，研究方向：食品毒理學(xué)。

An improved protocol for primary cultur of myocytes extracted from neonatal rat

BAO Xinhui, LI Xiaomei, YANG Yining, MA Yitong, CHEN Bangdang, TAO Jing, CHEN Xiaocui

(DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830054,China)

Abstract:ObjectiveTo improve the traditional method of culturing neonatal rat myocytes for the better purity, survival rate and activity of myocytes in experiments. MethodsTrypsin and type Ⅱ collagen enzyme were used to digest heart tissue and myocytes were purified with differential sticking wall method and chemical purification. ResultsThe extracted single myocyte is of structural integrity and circular shape. Most cells were touching to wall in 12 hours, and all cells sticking to wall in 24 hours, with small amount of floating cells. The touching-wall cells extended pseudopodia in the form of fusiformis, triangle and so on, with independent rhythm. Myocardial cells′ pseudopodia became connected into webs 48 hours later, with local synchronization rhythm. There days later, myocytes gethered into clusters, with island-like pulse. The activity and purity of myocytes was up to 96%. ConclusionThis method helped improve the activity and purity of myocytes, and protect the integrity of cells. The extracted myocytes could be used in relative experiments.

Key words: myocardial cell; primary culture; neonatal rat

乳鼠心肌細(xì)胞常被用作體外實(shí)驗(yàn)研究模型，用于心血管病的基礎(chǔ)研究。雖然早在1960年，Harary等[1]已提出原代乳鼠心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，但由于這一傳統(tǒng)方法所分離的心肌細(xì)胞存活率及純度低、細(xì)胞活性差等原因，尚不能滿足于基礎(chǔ)研究的需求。目前所報(bào)道的培養(yǎng)方法大多基于傳統(tǒng)方法進(jìn)行改進(jìn)[2-12]，主要分為單一酶消化法和混合酶消化法2種，前者單一使用胰酶消化會(huì)引起心肌細(xì)胞消化過(guò)度，降低心肌細(xì)胞的存活率；后者則由于消化能力減弱造成心肌組織消化不完全，獲得心肌細(xì)胞數(shù)目較少。對(duì)于原代乳鼠心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)仍無(wú)統(tǒng)一的方法。為了得到純度及活力較高的心肌細(xì)胞而滿足于實(shí)驗(yàn)的需要，本研究對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法進(jìn)行了探索，改進(jìn)了傳統(tǒng)的分離方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新生SD大鼠乳鼠(1~3 d)，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備胰蛋白酶(Sigma)，Ⅱ型膠原酶(Sigma)，D-Hanks(武漢博士德生物工程有限公司)，高糖DMEM(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，青鏈霉素(Sigma)，5-溴脫氧尿核苷(Brdu，Sigma)，臺(tái)盼藍(lán)，抗cTNT抗體(Abcam)，二抗(Immuno Reagents)，驢血清，0.25% Triton-X100，4%多聚甲醛，PBS，DAPI(Immuno Reagents)，濾器，注射器，超凈臺(tái)(上海智城分析儀器制造有限公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)，水浴鍋，搖床，離心機(jī)，倒置熒光顯微鏡(Leica)。

1.2方法

1.2.1消化酶的配制胰酶和II型膠原酶均用D-Hanks配制，胰酶濃度為0.1%，Ⅱ型膠原酶濃度為0.08%，用NaHCO3或HEPES將pH調(diào)節(jié)為7.0~7.2。

1.2.2心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及純化取新生(1~3 d)SD乳鼠，75%乙醇消毒后開(kāi)胸剪取心臟，將心臟放入預(yù)冷的D-Hanks中，用鑷子輕輕擠壓排出殘留血液，剪取心尖1/3處，分別沿橫軸、縱軸將心室剪為花瓣樣，4~8瓣即可。將剪好的心肌組織放入提前配好并預(yù)冷的0.1%胰酶中，置于4℃冰箱水平搖床上，速度50次/min，過(guò)夜消化12~14 h。第2天用等體積的完全培養(yǎng)液中和胰酶，于37℃水浴搖床以90次/min速度震蕩10 min后吸棄上清液。用配好的II型膠原酶消化心肌組織，37℃水浴搖床以90次/min速度震蕩7~10 min，每次消化完的上清液吸入等體積的完全培養(yǎng)液中，將盛有含消化后上清液的離心管擰松瓶蓋置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，以此重復(fù)4~5次直至組織完全消化。所得的消化液1 200 r離心8 min。37℃水浴鍋預(yù)熱的完全培養(yǎng)液重懸得到細(xì)胞懸液，將其接種于直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中差速貼壁2次，時(shí)間分別為50、40 min。收集并計(jì)數(shù)差速貼壁后的細(xì)胞，用預(yù)熱的完全培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105/mL后加入Brdu 0.1 mmol/L。將細(xì)胞接種于6孔板中，用免疫熒光法檢測(cè)心肌細(xì)胞純度。靜置培養(yǎng)48 h后換液，2~3 d更換1次培養(yǎng)液。

1.2.3心肌細(xì)胞存活率檢測(cè)重懸時(shí)取細(xì)胞懸液稀釋為約1×106個(gè)/mL，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色，著色的為死細(xì)胞，其余為活細(xì)胞。顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞以計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)。

1.2.4心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察倒置熒光顯微鏡下觀察并記錄心肌細(xì)胞在1、2、3 d及1 w時(shí)的形態(tài)、自主搏動(dòng)情況及頻率。

1.2.5心肌細(xì)胞純度鑒定用免疫熒光法鑒定心肌細(xì)胞純度，一抗為抗心肌肌鈣蛋白T抗體，二抗標(biāo)有紅色熒光。將培養(yǎng)72 h的接有心肌細(xì)胞的6孔板用PBS清洗2~3遍，室溫下4%多聚甲醛固定10 min，0.25% Triton-X100透化10 min，驢血清封閉30 min后加入一抗孵育1 h。加入二抗避光孵育1 h后用DAPI 1 μg/mL染色1 min。于倒置熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)心肌細(xì)胞。

2結(jié)果

2.1心肌細(xì)胞存活率臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)356個(gè)細(xì)胞中12個(gè)染色陽(yáng)性，344個(gè)染色陰性，細(xì)胞存活率為96.6%。

2.2心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)剛分離出的單個(gè)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,呈類(lèi)圓形，12 h后大部分心肌細(xì)胞貼壁，出現(xiàn)少量的自主搏動(dòng)，頻率緩慢(5~10次/min)，24 h后幾乎全部貼壁，僅見(jiàn)少量漂浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞伸出偽足，呈梭形、三角形等，貼壁細(xì)胞的細(xì)胞核大且胞漿豐富，立體感明顯且折光性好，細(xì)胞出現(xiàn)自主搏動(dòng)，搏動(dòng)頻率不同，為20~30次/min(圖1)。48 h后心肌細(xì)胞偽足間形成聯(lián)接,交織成網(wǎng)狀，局部心肌細(xì)胞出現(xiàn)同步搏動(dòng)(圖2)。3 d后心肌細(xì)胞聚集成簇，呈島嶼樣或放射狀搏動(dòng)(圖3)。1 w后細(xì)胞搏動(dòng)逐漸減弱，并出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、脫落。

2.3心肌細(xì)胞純度鑒定倒置熒光顯微鏡下鑒定心肌細(xì)胞(圖4)，紅色為與熒光標(biāo)記二抗結(jié)合的特異性心肌肌鈣蛋白cTNT，藍(lán)色為DAPI所染細(xì)胞核。計(jì)數(shù)后心肌細(xì)胞純度>96%。

3討論

心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)是心血管疾病基礎(chǔ)研究中一個(gè)重要部分，如何分離培養(yǎng)出純度高、活性好的心肌細(xì)胞對(duì)于實(shí)驗(yàn)研究至關(guān)重要。本研究對(duì)傳統(tǒng)的原代乳鼠心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)方法進(jìn)行了改進(jìn)，所提取培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞存活率及純度高，細(xì)胞活性好，結(jié)構(gòu)完整，可用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)中乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)，認(rèn)為關(guān)鍵是平衡鹽溶液的選擇、溶液pH的調(diào)節(jié)、溫度的調(diào)節(jié)、消化酶的選擇及差速貼壁及化學(xué)藥物抑制成纖維細(xì)胞。

ABC

圖124 h后心肌細(xì)胞形態(tài)(A、B、C 分別為×100、×200、×400)

圖248 h后心肌細(xì)胞形態(tài)(×100)>圖372 h后心肌細(xì)胞形態(tài)(×100)A(×100) B(×400)

圖4免疫熒光結(jié)果 ×400倍下可見(jiàn)心肌細(xì)胞肌絲結(jié)構(gòu)

3.1平衡鹽溶液的選擇平衡鹽溶液的選擇非常重要，以往常用于配制試劑的平衡鹽溶液主要有PBS、Hanks。然而，由于PBS、Hanks中含有Ca2+、Mg2+,能降低胰酶活性，因此在配置胰酶時(shí)要選擇不含Ca2+、Mg2+的鹽溶液以免胰酶活性降低而達(dá)不到消化的目的[13]。本研究參照文獻(xiàn)[13]選擇不含Ca2+、Mg2+的D-Hanks來(lái)配制胰酶。

3.2溶液pH的調(diào)節(jié)離體心肌細(xì)胞對(duì)pH非常敏感，培養(yǎng)液過(guò)酸或過(guò)堿均會(huì)影響心肌細(xì)胞的貼壁能力及活性[13]。本研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液pH在7.0~7.2時(shí)細(xì)胞貼壁最好，活性最佳。本實(shí)驗(yàn)在調(diào)節(jié)培養(yǎng)液及D-Hanks的pH值時(shí)添加了HEPES 10 mmol/L，因HEPES緩沖能力較強(qiáng)而無(wú)毒，有利于保持穩(wěn)定的酸堿度。

3.3溫度的調(diào)節(jié)在心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)的整個(gè)過(guò)程中溫度的控制非常重要。0.1%胰酶消化4℃過(guò)夜目的是降低胰酶的消化強(qiáng)度，使胰蛋白酶緩慢滲透到心肌組織內(nèi)部，較溫和地將細(xì)胞消化下來(lái)而又不傷害細(xì)胞膜和破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)[10-11]。以此方法預(yù)處理后所得的心肌細(xì)胞存活率及活性要高于37℃消化預(yù)處理。由于分離下來(lái)的心肌細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境較敏感，本實(shí)驗(yàn)將完全培養(yǎng)液37℃水浴預(yù)熱，使心肌細(xì)胞所處環(huán)境溫度保持穩(wěn)定，降低了外界溫度變化對(duì)心肌細(xì)胞引起的傷害。

3.4消化酶的選擇目前最常用于心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)的消化酶有胰蛋白酶和膠原酶[8-13]。胰蛋白酶主要用于分解組織間的蛋白成分，作用較強(qiáng)，使用時(shí)要把握好消化的濃度以及時(shí)間，消化過(guò)度會(huì)分解細(xì)胞膜表面蛋白破壞細(xì)胞膜，進(jìn)而破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能[14-15]。膠原酶能特異性地分解組織間的膠原纖維以釋放心肌細(xì)胞，作用較溫和，不會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞造成傷害[2-5]。本研究選擇低濃度0.1%胰酶4℃過(guò)夜預(yù)處理心肌組織，目的是使胰蛋白酶緩慢滲透到心肌組織內(nèi)部，分解組織間質(zhì)蛋白，使組織變疏松，之后再用Ⅱ型膠原酶多次消化。Ⅱ型膠原酶的濃度可根據(jù)使用乳鼠的心臟組織的個(gè)數(shù)來(lái)調(diào)整，少于10個(gè)心臟組織時(shí)Ⅱ型膠原酶濃度用0.08%，多于10個(gè)心臟組織可將濃度提高到0.1%。由于膠原酶消化能力較為緩和，可適當(dāng)提高膠原酶濃度。

3.5差速貼壁及化學(xué)藥物抑制成纖維細(xì)胞不同的細(xì)胞種類(lèi)貼壁的時(shí)間不同，所分離的細(xì)胞中成纖維細(xì)胞較心肌細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)，較早即可貼壁，因此可用差速貼壁法來(lái)分離心肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞。傳統(tǒng)的方法差速貼壁1次，貼壁90 min，但由于細(xì)胞平鋪于皿底，很多漂浮在培養(yǎng)液上層的成纖維細(xì)胞接觸不到皿底，不能使成纖維細(xì)胞與皿底充分接觸。本實(shí)驗(yàn)采用2次差速貼壁方法，加大了成纖維細(xì)胞與皿底接觸的機(jī)會(huì)，有利于提高心肌細(xì)胞的純度。Brdu的作用機(jī)理是代替胸腺嘧啶核苷參與DNA的合成，從而抑制生長(zhǎng)細(xì)胞的增殖。研究表明，Brdu不會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞造成影響[16]。本實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)液中加入Brdu,可在細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)中抑制成纖維細(xì)胞的增殖，保證心肌細(xì)胞的純度。

本研究通過(guò)胰酶4℃過(guò)夜緩慢消化以及膠原酶溫和特異性消化，并且控制液體的pH值和溫度來(lái)提高細(xì)胞的存活率，用不含谷氨酰胺的完全培養(yǎng)液，2次差速貼壁以及化學(xué)藥物來(lái)抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)提高心肌細(xì)胞純度。通過(guò)以上這些改進(jìn)可得到純度高、活性好且存活率高、結(jié)構(gòu)功能完整的心肌細(xì)胞，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究創(chuàng)造了條件。

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(本文編輯楊晨晨)

通信作者：田樹(shù)革， 男，博士， 教授， 博士生導(dǎo)師， 研究方向： 中藥質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)， E-mail: tsgyz@sina.com。

通信作者：劉濤(1974-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：食品毒理學(xué)，E-mail：xjmult@163.com。