甲基硝基亞硝基胍對(duì)哈薩克族正常食管上皮細(xì)胞LRRFIP1、ALDH1L1基因甲基化及其表達(dá)的影響

甲基硝基亞硝基胍對(duì)哈薩克族正常食管上皮細(xì)胞LRRFIP1、ALDH1L1基因甲基化及其表達(dá)的影響

陳艷1， 鄧彥超2,3， 黃思語(yǔ)1

(1新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，3新疆食管癌研究所， 烏魯木齊830011)

摘要:目的探討N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)對(duì)哈薩克族(哈族)正常食管上皮細(xì)胞LRRFIP1、ALDH1L1基因甲基化及其表達(dá)的影響。方法將體外培養(yǎng)的哈族正常食管上皮細(xì)胞暴露于含0、0.75、1.5、3 μg/mL MNNG的培養(yǎng)基中24 h，分別為對(duì)照組、0.75 μg/mL組、1.50 μg/mL組、3.00 μg/mL組。用甲基化特異性聚合酶鏈(MSP)法檢測(cè)LRRFIP1、ALDH1L1基因甲基化狀態(tài)，用RT-PCR和Western Blot法檢測(cè)LRRFIP1、ALDH1L1基因mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，各濃度組細(xì)胞LRRFIP1基因甲基化狀態(tài)沒(méi)有改變；各組細(xì)胞LRRFIP1基因mRNA表達(dá)水平分別為(1.021±0.237)、(2.828±0.350)、(1.453±0.179)、(1.952±0.223);與對(duì)照組比較,0.75 μg/mL組和3.00 μg/mL組表達(dá)均升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較，1.50 μg/mL和3.00 μg/mL組LRRFIP1蛋白表達(dá)水平均升高，分別為(4.233±0.048)、(4.519±0.033)、(5.377±0.057)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高濃度組細(xì)胞ALDH1L1基因有從部分甲基化向完全甲基化轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)，各組ALDH1L1基因mRNA表達(dá)水平分別為(1.023±0.254)、(5.046±0.603)、(2.259±0.030)、(7.616±1.910)，與對(duì)照組比較各濃度組均升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各組細(xì)胞ALDH1L1蛋白表達(dá)水平分別為(0.725±0.014)、(0.913±0.033)、(1.142±0.010)、(1.334±0.047)，與對(duì)照組比較各濃度組均升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論MNNG可促進(jìn)哈族正常食管上皮細(xì)胞ALDH1L1基因甲基化及LRRFIP1、ALDH1L1表達(dá)的升高。

關(guān)鍵詞：哈薩克族； 食管上皮細(xì)胞； LRRFIP1； ALDH1L1

中圖分類(lèi)號(hào)：R735.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.05.008

[收稿日期：2014-09-22]

Effects of MNNG on methylation and expression of LRRFIP1, ALDH1L1

on Kazakh normal esophageal epithelial cells

CHEN Yan1, DENG Yanchao2,3, HUANG Siyu1

(1PublicHealthCollege,XinjiangMedicalUniversity,2DepartmentofChestSurgery,

TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,3XinjiangInstituteforEsophageal

CancerResearch,Urumqi830011，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of MNNG on methylation and expressions of LRRFIP1 and ALDH1L1 on Kazakh normal esophageal epithelial cells. MethodsMethylation of LRRFIP1 and ALDH1L1 were detected by MSP, the mRNA and protein level of LRRFIP1 and ALDH1L1 were detected by RT-PCR and Western Blot. ResultsCompared with the control group, each group of cells with LRRFIP1 gene methylation status did not change, the expressions of LRRFIP1 mRNA level in each groups were (1.021±0.237), (2.828 ±0.350), (1.453±0.179), (1.952±0.223), the LRRFIP1 mRNA level in low concentration group and high concentration group of cells were significantly higher than the control group (P<0.05), the expressions of LRRFIP1 protein level in control group and high concentration group were (4.233±0.048), (5.377±0.057), the LRRFIP1 protein level in high concentration group of cells were significantly higher than the control group (P<0.05), high concentration group of cells with ALDH1L1 gene was trended from partial methylation to completely methylation, the expressions of ALDH1L1 mRNA level in each groups were (1.023±0.254), (5.046±0.603), (2.259 ±0.030), (7.616±1.910), the ALDH1L1 mRNA level in each group was significantly higher than the control group (P<0.05), the expressions of ALDH1L1 protein level in each groups were (0.725±0.014), (0.913±0.033), (1.142±0.010), (1.334±0.047), the ALDH1L1 protein level in each concentration groups were significantly increased (P<0.05). ConclusionAt some concentration point, MNNG significantly affects the methylation of ALDH1L1 and the expressions of p16 and FHIT on Kazakh normal esophageal epithelial cells.

Key words: Kazakh; esophageal epithelial cells;LRRFIP1;ALDH1L1

亞硝胺類(lèi)化合物屬亞硝基化合物，包括亞硝胺與亞硝酞胺兩類(lèi)。目前為止已發(fā)現(xiàn)的亞硝胺有300多種，其中90%以上的亞硝胺化合物對(duì)動(dòng)物有致畸、致突變及致癌作用[1]。N-亞硝胺類(lèi)烷化劑能誘導(dǎo)多種疾病的發(fā)生。研究結(jié)果表明，N-亞硝胺類(lèi)化合物是誘發(fā)人類(lèi)癌癥的原因之一[2-3]。N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)是一種人工合成的亞硝胺類(lèi)化合物，常被用于研究亞硝胺類(lèi)化合物誘發(fā)腫瘤的工具。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，MNNG可以導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生[4-5]。富含亮氨酸重復(fù)序列相互作用蛋白1[(leucinerich repeat(in FLII) interacting protein 1，LRRFIP1)]基因位于人類(lèi)17號(hào)染色體上，是腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族的信號(hào)組成成分[6]。醛脫氫酶1家族L1基因(aldehyde dehydrogenase 1 family member L1，ALDH1L1)位于人類(lèi)3號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上(3q21.2)，參與細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)，是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一個(gè)與葉酸代謝有關(guān)的酶基因[7]。本課題組的前期研究結(jié)果表明，在哈薩克族(哈族)食管癌患者癌組織中LRRFIP1和ALDH1L1基因發(fā)生了甲基化[8-9]。本研究使用MNNG對(duì)體外培養(yǎng)的哈族食管正常上皮細(xì)胞染毒，從而模擬N-亞硝胺類(lèi)化合物暴露后，正常食管上皮細(xì)胞LRRFIP1和ALDH1L1基因甲基化狀態(tài)及其表達(dá)的變化，初步探討N-亞硝胺類(lèi)化合物致食管上皮組織發(fā)生病變的機(jī)制。

1材料與方法

1.1細(xì)胞與主要試劑哈族食管正常上皮細(xì)胞株(課題組自行培養(yǎng)的原代細(xì)胞)，MNNG(TCI公司)，甲基化修飾試劑盒(Chemicon公司)，Trizon提取試劑盒(Invitrogen公司)，cDNA第一鏈合成試劑盒(Ambion公司)，引物(上海生工生物工程技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)哈族食管正常上皮細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于EpicM-2無(wú)血清培養(yǎng)基中(內(nèi)含青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至90%時(shí)按照1∶3傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)培養(yǎng)瓶加入含不同濃度(0、0.75、1.50、3.00 μg/mL)MNNG的培養(yǎng)基5 mL，分別為對(duì)照組、0.75 μg/mL組、1.50 μg/mL組和3.00 μg/mL組。

1.2.2MSP法檢測(cè)LRRFIP1、ALDH1L1基因甲基化狀態(tài)

1.2.2.1總DNA的提取細(xì)胞染毒24 h后，采用血液基因組DNA快速抽提試劑盒提取總DNA。

1.2.2.2甲基化特異性PCR(1)引物合成：由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)、合成，引物序列見(jiàn)表1。(2)亞硫酸氫鈉修飾：采用甲基化修飾試劑盒對(duì)提取的DNA進(jìn)行修飾。(3)擴(kuò)增體系：包括dNTPs 0.5 μL、Forward primer 0.5 μL、Reverse primer 0.5 μL、DNA模板2.0 μL、Taq Buffer 2.5 μL、MgCl22.0 μL、Taq酶(5 U/μL) 0.2 μL，加水補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4 min，94℃變性25 s(甲基化63℃、非甲基化60℃)，72℃延伸30 s，共25個(gè)循環(huán)，最后72℃ 5 min。將擴(kuò)增好的DNA行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)BioSens Gel Imaging System軟件照相處理。

1.2.3RT-PCR法檢測(cè)LRRFIP1、ALDH1L1 mRNA表達(dá)

1.2.3.1總RNA提取及cDNA合成采用Trizol提取試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA。

表1　啟動(dòng)子區(qū)特異性引物序列

1.2.3.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR(1)引物合成：由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)、合成，以管家基因GAPDH為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表2。(2)擴(kuò)增體系：包括SybrGreen qPCR Master Mix(2×) 10.0 μL 、上游與下游引物各1.0 μL 、cDNA 1.0 μL 、ddH2O 7.0 μL，總體積20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性10 s，LRRFIP1、ALDH1L1基因58℃和GAPDH基因57℃ 40 s，60℃延伸40 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃ 5 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，采用2-△△CT法分析目的基因在對(duì)照組和各濃度組的表達(dá)差異。

表2　逆轉(zhuǎn)錄PCR引物序列

1.2.4Western blot 法檢測(cè)LRRFIP1、ALDH1L1蛋白表達(dá)細(xì)胞經(jīng)不同濃度MNNG染毒24 h后，加入細(xì)胞裂解液，充分混勻，離心，將提取的蛋白變性，10% SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法低壓轉(zhuǎn)膜2.5 h。TBST漂洗后用5%的脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，TBST漂洗后將PVDF膜放入稀釋的一抗(LRRFIP1抗體1∶200、ALDH1L1抗體1∶200、GAPDH抗體1∶1 000)中4℃過(guò)夜孵育。TBST漂洗，PVDF膜放入稀釋的辣根酶標(biāo)記的二抗溶液中，37℃孵育l h。在暗室中避光顯色，并照X線(xiàn)片。用凝膠圖像掃描分析系統(tǒng)對(duì)所得目的蛋白與內(nèi)參蛋白的X線(xiàn)片分析，用灰度分析軟件對(duì)每個(gè)條帶的灰度值進(jìn)行測(cè)定，獲得每條目的蛋白及內(nèi)參蛋白的灰度值，目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

2結(jié)果

2.1LRRFIP1、ALDH1L1基因甲基化狀態(tài)

2.1.1LRRFIP1基因甲基化檢測(cè)結(jié)果 哈族食管上皮細(xì)胞經(jīng)MNNG作用24 h后，對(duì)照組與0.75、1.50、3.00 μg/mL組的PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。各組均可見(jiàn)LRRFIP1基因無(wú)甲基化的特異性基因片段(186 bp)表達(dá)，未見(jiàn)LRRFIP1基因甲基化特異性基因片段(185 bp)表達(dá)，說(shuō)明哈族食管正常上皮細(xì)胞經(jīng)不同濃度MNNG染毒24 h后LRRFIP1基因甲基化狀態(tài)保持無(wú)甲基化狀態(tài)不變。

M：LRRFIP1-M特異性引物擴(kuò)增條帶185 bp；U：LRRFIP1-U特異性引物擴(kuò)增條帶186 bp，1、2、3、4分別為對(duì)照組和0.75、1.50 、3.00 μg/mL組，5為甲基化基因標(biāo)準(zhǔn)品

圖1MSP法檢測(cè)哈族食管上皮細(xì)胞經(jīng)MNNG染毒后LRRFIP1基因甲基化狀態(tài)

2.1.2ALDH1L1基因甲基化檢測(cè)結(jié)果 哈族食管上皮細(xì)胞經(jīng)MNNG作用24 h后，對(duì)照組和0.75、1.50、3.00 μg/mL組的PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。各組均可見(jiàn)ALDH1L1基因無(wú)甲基化特異性基因片段(127 bp)及ALDH1L1基因甲基化特異性基因片段(115 bp)的表達(dá)。3.00 μg/mL組無(wú)甲基化特異性片段亮度明顯較對(duì)照組和0.75、1.50 μg/mL組弱，而甲基化特異性片段亮度較對(duì)照組和0.75、1.50 μg/mL組強(qiáng)，說(shuō)明3.00 μg/mL組ALDH1L1基因啟動(dòng)子區(qū)有部分胞嘧啶發(fā)生了甲基化。

2.2LRRFIP1、ALDH1L1基因mRNA及蛋白表達(dá)

2.2.1LRRFIP1基因mRNA表達(dá) MNNG染毒24 h后，各組細(xì)胞間LRRFIP1基因表達(dá)水平不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=27.680，P<0.05)。0.75 μg/mL組LRRFIP1基因表達(dá)水平上調(diào)，是對(duì)照組的2.828倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.398，P<0.01)；與對(duì)照組比較，1.50 μg/mL組LRRFIP1基因表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.515，P>0.05)；與對(duì)照組比較，3.00 μg/mL組LRRFIP1基因表達(dá)水平是對(duì)照組的1.952倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.940，P<0.01)，見(jiàn)表3。

M： ALDH1L1-M特異性引物擴(kuò)增條帶115 bp；U：ALDH1L1-U特異性引物擴(kuò)增條帶127 bp，1、2、3、4分別為對(duì)照組和0.75、1.50 、3.00 μg/mL組，5為甲基化基因標(biāo)準(zhǔn)品

圖2MSP法檢測(cè)哈族食管上皮細(xì)胞經(jīng)MNNG染毒后

ALDH1L1基因甲基化狀態(tài)

2.2.2LRRFIP1蛋白表達(dá)哈族正常食管上皮細(xì)胞經(jīng)MNNG染毒24 h后，各組細(xì)胞LRRFIP1蛋白表達(dá)水平不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=139.271，P<0.01)，LRRFIP1蛋白表達(dá)水平隨染毒劑量的增加而升高(r=0.888，P<0.01)。與對(duì)照組比較，0.75 μg/mL組LRRFIP1蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.488，P>0.05)；1.50 μg/mL和3.00 μg/mL組LRRFIP1蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.894，P<0.05； t=20.599， P<0.01)，見(jiàn)表3、圖3。

1：對(duì)照組； 2：0.75 μg/mL； 3：1.50 μg/mL； 4：3.00 μg/mL

圖3　哈族食管上皮細(xì)胞經(jīng)MNNG染毒后LRRFIP1蛋白表達(dá)

注: 與對(duì)照組比較，△P<0.05； 與0.75 μg/mL組比較，▲P<0.05； 與1.50 μg/mL組比較，#P<0.05。

2.2.3ALDH1L1基因mRNA表達(dá) MNNG染毒24 h后，各組細(xì)胞間ALDH1L1基因表達(dá)水平不同，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.561，P<0.05)，ALDH1L1基因表達(dá)水平隨染毒劑量的增加而升高(r=0.764，P<0.05)。與對(duì)照組比較，0.75 μg/mL組ALDH1L1基因表達(dá)水平是對(duì)照組的5.046倍，ALDH1L1基因表達(dá)水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.648，P<0.01)；與對(duì)照組比較，1.50 μg/mL組ALDH1L1基因表達(dá)水平是對(duì)照組的2.259倍，ALDH1L1基因表達(dá)水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.377，P<0.01)；3.00 μg/mL組ALDH1L1基因表達(dá)水平上調(diào)是對(duì)照組的7.616倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.926，P<0.01)，見(jiàn)表4。

2.2.4ALDH1L1蛋白表達(dá) 哈族正常食管上皮細(xì)胞經(jīng)MNNG染毒24 h后，各組細(xì)胞ALDH1L1蛋白表達(dá)水平不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=156.617，P<0.01)，ALDH1L1蛋白表達(dá)水平隨染毒劑量的增加而升高(r=0.976，P<0.01)。與對(duì)照組相比，0.75、1.50 、3.00 μg/mL組ALDH1L1蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t′=7.410，P<0.05；t=33.861，P<0.01；t′=17.493，P<0.01)，見(jiàn)表4、圖4。

1：對(duì)照組； 2：0.75 μg/mL； 3：1.50 μg/mL； 4：3.00 μg/mL

圖4哈族食管上皮細(xì)胞經(jīng)MNNG染毒后ALDH1L1蛋白表達(dá)

3討論

食管癌(esophageal cancer, EC)是發(fā)生于食管上皮組織的常見(jiàn)消化系統(tǒng)惡性腫瘤，主要流行于發(fā)展中國(guó)家，世界食管癌發(fā)病率存在顯著的地域差異，高發(fā)區(qū)與低發(fā)區(qū)人群食管癌死亡率和發(fā)病率相差可達(dá)500倍[10]。不同種族食管癌發(fā)病率有很大差異，新疆是我國(guó)食管癌高發(fā)區(qū)之一，以哈薩克族人群死亡率最高[11]。

研究表明LRRFIP1基因在動(dòng)物胚胎發(fā)育、表皮生長(zhǎng)、平滑肌細(xì)胞的發(fā)育以及腫瘤和心血管病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[12]。新疆哈薩克族食管鱗癌DNA異常甲基化基因發(fā)現(xiàn)LRRFIP1基因在癌組織中發(fā)生甲基化[13]。在乳腺癌患者非癌組織中LRRFIP1蛋白表達(dá)弱陽(yáng)性，而乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和浸潤(rùn)性小葉癌組織中超過(guò)50%的組織表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性，并且LRRFIP1基因的表達(dá)強(qiáng)度與淋巴浸潤(rùn)程度有關(guān)[14]。

表4　哈族食管上皮細(xì)胞經(jīng)MNNG染毒后ALDH1L1基因及蛋白表達(dá)(n=3, ±s)

注： 與對(duì)照組比較，△P<0.05； 與0.75 μg/mL組比較，▲P<0.05； 與1.50 μg/mL組比較，#P<0.05。

研究表明ALDH1L1基因有類(lèi)似抑癌基因的特性，具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[15-16]。Natalia等[7]檢測(cè)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、肝癌細(xì)胞系HePG2和結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116的啟動(dòng)子CpG島甲基化水平，結(jié)果表明這3種細(xì)胞系的ALDH1L1基因啟動(dòng)子均發(fā)生甲基化。本課題組的前期研究結(jié)果表明新疆哈薩克族食管鱗癌DNA異常基因甲基化中ALDH1L1基因發(fā)生甲基化，該基因參與甲酰四氫葉酸的分解代謝及一碳化合物的分解代謝[13]。ALDH1L1基因在多種腫瘤細(xì)胞系中低表達(dá)，包括肝癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌細(xì)胞系等[17]。Natalia等[16]對(duì)肺腺癌組織及相對(duì)應(yīng)癌旁組織和肝癌組織及相對(duì)應(yīng)癌旁組織ALDH1L1基因mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，研究結(jié)果表明，在肺腺癌組織及肝癌組織中ALDH1L1基因mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)應(yīng)的癌旁組織。研究發(fā)現(xiàn)ALDH1L1基因在肝癌中的表達(dá)，在癌組織中ALDH1L1 mRNA及蛋白表達(dá)水平與正常組織相比顯著下降，癌旁正常組織ALDH1L1 mRNA表達(dá)水平是癌組織的10倍，ALDH1L1基因表達(dá)下降影響是肝癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素[18]。

本研究采用不同濃度MNNG對(duì)哈族正常食管上皮細(xì)胞染毒24 h后檢測(cè)各濃度組LRRFIP1、ALDH1L1基因的甲基化狀態(tài)及其表達(dá)。研究結(jié)果表明，LRRFIP1基因一直處于無(wú)甲基化狀態(tài)，而經(jīng)高濃度MNNG處理后的哈族食管上皮細(xì)胞ALDH1L1基因甲基化特異性片段表達(dá)較對(duì)照組和0.75、1.5 μg/mL組高，非甲基化特異性片段表達(dá)較對(duì)照組和低、中濃度組低，說(shuō)明高濃度MNNG使得哈族食管上皮細(xì)胞ALDH1L1基因有甲基化的趨勢(shì)。與對(duì)照組比較，LRRFIP1和ALDH1L1基因mRNA及蛋白表達(dá)水平均與MNNG濃度呈正相關(guān)，隨MNNG濃度的增高表達(dá)上調(diào)。說(shuō)明基因甲基化的發(fā)生是基因表達(dá)下調(diào)的原因之一，在哈族食管癌的發(fā)生過(guò)程中，最先發(fā)生甲基化的是與葉酸代謝有關(guān)的基因ALDH1L1，這對(duì)今后預(yù)防哈族食管癌的發(fā)生具有重要意義。

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(本文編輯楊晨晨)